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黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)是黄病毒科(Flavivirus)的原型病毒,能够导致黄热病的发生。黄热病毒主要流行于南美洲、非洲的热带和亚热带地区,据估计,全球每年有80000至200000人感染黄热病毒,其中有30000至60000人死亡。由于缺乏对YFV与宿主相互作用的分子机制及其致病性的了解,临床上现阶段并无有效的治疗药物。黄热病毒-17D(YFV-17D)是黄热病毒减毒疫苗株,被广泛应用于预防YFV的感染。YFV-17D与Asibi病毒株仅有0.63%的核酸序列差异以及0.94%的氨基酸序列差异。因为它不具备致病性,所以可以在BSL-2的实验室里培养,是研究YFV的理想模型。全基因组功能丧失筛选(Genome-wide Loss-of-Function Screening)是寻找影响特定生物学行为关键基因的重要工具,有助于我们理解生物学行为内在的分子机制。于基于RNA干扰技术的全基因组敲低筛选系统的相比,CRISPR基因敲除技术具有更高效的敲除效率,更低的脱靶效率等优点。近年来,基于CRISPR-Cas9技术的全基因组敲除筛选系统在病毒-宿主相互作用领域中的应用,有助于我们发现调控病毒感染的宿主因子,是理解病毒感染的分子机制的重要工具和研究平台。例如,该筛选体系的应用在西尼罗河病毒(West Nile Virus,WNV)、登革热病毒(Dengue Virus,DENV)等病毒的研究中发现了新的关键宿主因子,为我们理解和治疗这些病毒引发的疾病提供了新的研究线索。本研究旨在建立基于CRISPR-Cas9技术的全基因组敲除筛选体系,将该系统应用于YFV与宿主相互作用的研究中,以发现调控YFV感染的关键宿主因子。我们使用YFV-17D作为建立该系统的病毒模型,包装出具有感染能力的完整YFV-17D疫苗株病毒。首先,我们验证了 YFV-17D可以在人类肝癌细胞系Huh7细胞中完成完整的生命周期,能包装出具有感染能力的完整病毒。因为该细胞株能在感染YFV-17D时出现细胞病理效应(Cytopathic effect,CPE),所以我们选取了 Huh7细胞作为CRISPR-Cas9全基因组敲除筛选调控YFV-17D感染的宿主因子的细胞模型。随后,我们将CRISPR文库 GeCKO(Genome-scale CRISPRKnock-Out)文库包装成慢病毒文库后转导Huh7细胞,并使用YFV-17D进行感染。感染后筛选到对YFV-17D产生抵抗从而存活下来的细胞群,通过对他们所携带的guide RNA(gRNA)进行深度测序,以检测这些细胞中gRNA的丰度,我们鉴定出了数个候选的正向调控YFV-17D感染的宿主因子。其中,靶向基因ZNF629的gRNA具有最多拷贝数和富集。通过建立2株携带靶向ZNF629基因gRNA并对YFV-17D感染产生高抵抗力的单克隆细胞株,我们发现这2株细胞上清培养液中释放的YFV-17D病毒颗粒显著减少,这些初步数据提示ZNF629可能是一个能正向调控YFV-17D感染的宿主因子。在后续实验中,我们还需要验证ZNF629是否为真实的正向调控YFV-17D感染的宿主因子以及对它如何调控其感染的分子机制做深入的研究。综上所述,我们建立了基于CRISPR-Cas9技术的全基因组敲除筛选系统,以Huh7细胞为细胞模型,应用于黄热病毒与宿主相互作用的研究中。我们发现部分Huh7细胞对YFV-17D感染产生抵抗并筛选到了包括ZNF629在内的数个调控该病毒感染的候选宿主因子。本文所建立的应用于YFV与宿主相互作用研究的筛选系统筛选方法简单有效,在YFV研究中有重要的应用价值。