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结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种经呼吸道传播的慢性传染病,在全球传播范围最广、持续时间最久、死亡率最高,是全球十大死因之一。目前临床应用的结核疫苗仅有卡介苗(BCG)一种。虽然卡介苗可以有效预防儿童重症结核,但对成年人的保护效果较差。因此,亟需开发新型结核疫苗来预防结核病,保护未感染者和潜伏感染患者。亚单位疫苗是一种新型疫苗。相比于全菌灭活疫苗和减毒活疫苗,亚单位疫苗选择有效的免疫原性成分,副作用小。我们实验室前期将结核分枝杆菌生长期优势抗原ESAT6和潜伏期优势表达的蛋白Rv2626c联合构建了融合蛋白ESAT6-Rv2626c(简称LT29)。本研究通过优化LT29发酵和蛋白纯化技术,为结核亚单位疫苗中试研究和转化应用奠定了基础。蛋白质亚单位疫苗需要佐剂辅助才可以诱导较强的免疫应答,因此适当的佐剂对结核亚单位疫苗至关重要。目前,我国临床上使用的佐剂只有铝佐剂。铝佐剂可促进Th2型体液免疫应答,但无法引起Th1型细胞免疫应答。为此,我们实验室以阳离子脂质体二甲基双十八烷基溴化铵DDA为基础,联合Toll样受体3(TLR-3)激动剂聚肌胞Poly I:C,构建了可以诱导较强Th1型细胞免疫的佐剂DDA-Poly I:C(简称DP)。但我们前期的研究发现DP佐剂稳定性比较差,很容易发生絮凝,不能够满足临床疫苗应用的要求,因此本课题研究提高其稳定性,制备成合适的剂型,为DP佐剂转化应用奠定基础。目的:优化融合蛋白LT29发酵条件和蛋白纯化技术,表达并制备融合蛋白LT29;制备稳定的DP佐剂,并将DP佐剂制备成粉针剂型;检测亚单位疫苗LT29-DP的免疫原性。方法:1.将已构建好的融合蛋白ESAT6-Rv2626c(LT29)在大肠埃希菌BL21(DE3)中瓶摇表达和发酵罐进行发酵表达,建立稳定高效表达的条件;通过AKTA pure150蛋白纯化仪,利用离子交换柱、疏水柱和分子筛进行纯化。2.使用高压匀浆机对DP佐剂进行高压匀浆,筛选适宜压力,进行疫苗佐剂稳定性研究;筛选冻干保护剂,对DP佐剂进行冻干和再水化,进行冻干剂型研究;检测各种方法制备的DP佐剂的粒径和Zeta电位。3.在C57BL/6小鼠上检测亚单位疫苗LT29-DP的免疫原性。在第0、2、4周分别用PB、BCG、DP佐剂、ESAT6-DP、Rv2626c-DP、LT29-DP、LT29-新型DP佐剂和LT29-新型冻干DP佐剂免疫小鼠三次。末次免疫20周后,通过ELISA法检测脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的水平,通过EdU法检测淋巴细胞增殖水平,通过两次抗原刺激检测中央记忆T细胞。结果:1.融合蛋白LT29在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达良好,尤其在发酵罐中能高效表达;菌体破碎离心后,融合蛋白集中于上清之中;在AKTA蛋白纯化系统上,用HiTrap DEAE FF离子交换柱、HiTrap Butyl HP疏水柱和HiLoad 16/600Superdex 75分子筛对其进行逐步纯化,得到纯度高于95%的LT29目的蛋白。相对于BCG、ESAT6和Rv2626c,融合蛋白LT29可以激发机体产生强大的细胞免疫应答;注射LT29疫苗的C57BL/6小鼠淋巴细胞有更强的增殖能力,具有更长时间的免疫记忆。2.利用高压匀浆法,将DDA联合Poly I:C的DP佐剂进行200bar高压匀浆处理,可以将DP佐剂的粒径由542±17nm降低至428±25nm,大小均一;Zeta电位由23.48±2.93mV提高至45.19±1.02mV,DP佐剂的稳定性得到明显提高。分别用蔗糖和海藻糖作为冻干保护剂,对DP佐剂进行冻干处理。当海藻糖作为冻干保护剂时,再水化后粒径增大至664±28nm,Zeta电位降低至24.76±1.13mV,冻干再水化效果良好。而蔗糖作为保护剂时,粒径增加过大,Zeta电位降低过多,所以海藻糖更适合作为DP佐剂的冻干保护剂。经过匀浆和冻干的DP佐剂,和融合蛋白联合对C57BL/6小鼠进行免疫,产生的细胞免疫应答和免疫记忆不及未经处理的DP佐剂,免疫效果不佳。结论:1.本实验探索了融合蛋白LT29的菌液发酵和诱导表达条件;制定出离子交换层析-疏水层析-凝胶层析的三步纯化方案,制备出纯度高于95%的融合蛋白。免疫检测实验证实,融合蛋白LT29相对BCG、ESAT6和Rv2626c,具有更好且更长久的免疫保护效果。2.通过高压匀浆技术,改善了DP佐剂的均一性和稳定性;选择海藻糖作为冻干保护剂,尝试制备了干粉剂型。但免疫检测显示匀浆和冻干的DP佐剂效果不及未处理的DP佐剂。