各类生物水解酶对于医疗诊断、药物研究、工业生产等方面都有着至关重要的应用前景。通过对这类水解酶的活性及其抑制剂进行分析检测,可得到相关的生物信息,使其在各个领域能发挥更好的应用价值。用于检测该类水解酶的分析方法多种多样,且各具优缺点。其中荧光分析法是一种简单、快速、灵敏的检测方法。本论文主要以荧光分析法对磷脂酶C和脱氧核糖核酸酶Ⅰ的活性进行了研究。磷脂酶C(Phospholipase C,简称PLC)是磷酸二酯酶,其水解磷脂C3位点上的磷酸二酯键,产生二酰基甘油(DAG)和磷酰基,例如磷酸胆碱或磷酰肌醇。磷脂酶C在食品加工、油脂精炼、药品生产等领域有着广泛的应用。因此,定量检测PLC催化活性和抑制的能力是很重要的。目前检测PLC常用的方法有卵黄平板法、p-NPPC法、无机定磷法、薄板层析法、放射性元素标记法、荧光法、比浊法和滴定法。脱氧核糖核酸酶Ⅰ(Deoxyribonuclease Ⅰ,简称DNase Ⅰ)是一种DNA内切酶,其通过催化水解DNA链中磷酸主链上的磷酸二酯键将单链和双链DNA分子降解成小片段。实验表明,DNaseⅠ是一种有用的生物标志物,如在前列腺癌和系统性红斑狼疮患者体内DNaseⅠ表现出低的生物活性,而心肌梗死患者体内DNaseⅠ则表现出较高的生物活性。目前,许多分析方法被用作检测DNaseⅠ活性,如凝胶电泳法、ELISA、比色法、单径向酶扩散法等。但这些方法存在一定的弊端,如ELISA需要多个洗涤步骤,单径向酶扩散法需要长的消化时间。因此建立一种简单、快速、方便的检测DNaseⅠ活性的方法是迫切需要的。在本论文中,以荧光标记的脂质体为探针检测PLC的活性,以荧光标记的双链DNA为探针检测DNaseⅠ的活性。分别构建了简单、快速、高灵敏、高特异的检测PLC及DNaseⅠ的方法,并对两种酶的抑制剂进行了研究。论文主要由以下三章内容组成:第1章绪论由三部分组成,第一部分是对磷脂酶C进行概述,介绍磷脂酶及其底物、磷脂酶C及其检测方法;第二部分是对DNaseⅠ进行概述,主要对核酸酶和DNaseⅠ及其检测方法进行介绍;第三部分主要阐明了本论文的选题背景、研究目的和研究内容。第2章主要建立了一种通过自组装形成荧光标记的单层脂质体作为荧光探针检测PLC活性的方法。该荧光探针是由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和罗丹明B标记的磷脂酰乙醇胺(LissRhod PE)通过自组装形成单层荧光标记脂质体。在所形成的脂质体探针中,罗丹明B会发生荧光自淬灭,这一过程中伴随着体系荧光信号的大幅度猝灭。在该体系中加入目标物PLC,PLC的催化水解作用可以使脂质体探针发生降解,不断释放罗丹明B,自猝灭程度不断减小,从而使体系产生较强的荧光信号。利用此过程中荧光强度的变化对PLC活性进行检测。该方法的荧光强度与PLC浓度的线性范围为5U/L-300U/L,其检出限为2U/L。利用此方法来检测PLC的活性具有灵敏度高,操作简单等优点。本实验不仅对PLC的活性进行检测,还对PLC的抑制剂进行了研究。第3章主要构建了一种以荧光基团标记的双链DNA为荧光探针检测DNase Ⅰ活性的方法。该荧光探针是由荧光基团FAM标记的含30个碱基的单链DNA与其完全匹配的单链DNA通过杂交形成双链DNA。对于原始荧光探针FAM-dsDNA,由于其分子量相对较大,所以对应的荧光偏振度值也相对较大。向其中加入目标物DNase Ⅰ,DNase Ⅰ可以将DNA链水解切割成小片段,使与FAM相连的碱基数目减小即分子量减小,则对应的荧光偏振度值也相应减小。利用此过程中荧光偏振度值的变化对DNase Ⅰ进行检测。该方法中荧光偏振度值与DNase Ⅰ浓度所对应的线性范围为10 U/L～500 U/L,其检出限为6 U/L。该方法具有灵敏度高,步骤简单等特点,不仅可以对DNase Ⅰ的活性进行检测,而且可以用于其抑制剂的研究。