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第一部分靶向介孔二氧化硅纳米载药系统的制备及检测目的1.构建一种靶向性多肽Asn-Gly-Arg(NGR)修饰的介孔二氧化硅纳米载药系统(MSN-TMZ-PDA-NGR)。2.对纳米载药系统的特性进行检测。方法1.将MSN与TMZ混合搅拌,使TMZ吸附于MSN的介孔中。收集并干燥沉淀MSN-TMZ,加入PDA溶液中搅拌获得MSN-TMZ-PDA。将纯化后的沉淀在NGR溶液中,通过共价方式将NGR与MSN-TMZ-PDA相结合,得到MSN-TMZ-PDA-NGR。2.分别使用电镜、红外光谱分析、纳米粒径电位仪检测纳米载药系统的特性。收集制备过程中的成份计算药物载药率和包封率。结果经透射电子显微镜检测MSN和MSN-TMZ-PDA-NGR的直径分别62±5.91、70±8.26nm,激光粒径电位分析仪检测水合粒径分别为93.97±9.43、129.2±15.72nm,电位分别为-40.4、21.6m V。MSN修饰前后的红外光谱图出现特征性改变。此靶向纳米介孔二氧化硅载药系统的载药率和包封率分别为28.5%,38%。结论成功制备了一种NGR靶向的介孔二氧化硅纳米载药系统。该载药体系具备较良好的稳定性、载药率和包封率。第二部分靶向介孔二氧化硅纳米载药系统体外靶向和毒性研究目的1.验证制备的MSN-TMZ-PDA-NGR对胶质瘤细胞高摄取性,并证实其特异靶向性。2.验证制备的MSN-TMZ-PDA-NGR对胶质瘤细胞的毒性实验。3.探索MSN-TMZ-PDA-NGR对细胞毒性的机制,验证其自噬及凋亡的诱导作用。方法1.规范培育大鼠胶质瘤细胞C6,人胶质瘤细胞U87和大鼠星形胶质细胞AC。Western blot法检测三种细胞表面的CD13受体蛋白表达量。用罗丹明6G替代TMZ装载于MSN中制备MSN-Rh6G-PDA和MSN-Rh6G-PDA-NGR并加入培养的细胞中,在荧光显微镜下观察细胞对各药物制剂的摄取。2.规范培育胶质瘤细胞,分为TMZ、MSN-TMZ-PDA、MSN-TMZ-PDA-NGR和MSN-PDA-NGR组,分别加入不同浓度的药物处理相应时间。用CCK8法检测各组吸光度值,计算细胞活性和IC50值,评价药物的细胞毒性。3.规范培养胶质瘤细胞,将MSN-TMZ-PDA-NGR以不同浓度和时间加入处理。选择特异性自噬和凋亡蛋白anti-LC3B,anti-p62,anti-Caspase-3作为观察指标,通过Western-blotting法检测相关蛋白的表达。验证MSN-TMZ-PDA-NGR的自噬及凋亡诱导作用。4.规范培养胶质瘤细胞,分别用TMZ和MSN-TMZ-PDA-NGR处理,在特定时间收集细胞并固定,制作电子显微镜观测标本。在电子显微镜检测下直观地验证MSN-TMZ-PDA-NGR的自噬诱导作用。结果1.经Western-blot法检测,与大鼠星形胶质细胞AC相比,CD13在C6、U87细胞表面存在更高表达量。经荧光显微镜检测,MSN-Rh6G-PDA-NGR在两种胶质瘤细胞C6、U87的吸收量明显多于正常细胞AC。在两种胶质瘤细胞中,NGR靶向修饰的纳米粒能较快的被摄入细胞内,并在1h即到达高水平。预处理NGR后,细胞内荧光颗粒显著降低。2.在CCK8检测细胞毒性实验中,各包含TMZ的纳米制剂的细胞毒性作用明显。各组处理C6细胞24h后,TMZ,MSN-TMZ-PDA和MSN-TMZ-PDA-NGR的IC50值分别为127.50,422.00和21.02μg/mL,48h后分别为39.71,89.31和6.19μg/mL。各组处理U87细胞24h后,TMZ,MSN-TMZ-PDA和MSN-TMZ-PDA-NGR的IC50值分别为180.40,719.70和17.38μg/mL,48h后分别为32.11,124.50和7.43μg/mL。未载药物的MSN-PDA-NGR无明显细胞毒性。3.经Western-blot检测,MSN-TMZ-PDA-NGR可诱导C6,U87细胞发生自噬和凋亡,并且呈时间和浓度依赖性趋势。4.经电镜下观察,MSN-TMZ-PDA-NGR处理的细胞内出现的自噬小体和自噬溶酶体,且数量明显多于TMZ处理组。结论MSN-TMZ-PDA-NGR具有良好的靶向性和细胞毒性,可诱导胶质瘤细胞发生自噬和凋亡,为进一步实验提供依据。第三部分3-甲基腺嘌呤联合NGR修饰的介孔二氧化硅载替莫唑胺治疗胶质瘤的体外研究目的验证自噬抑制剂3-MA对MSN-TMZ-PDA-NGR引起的自噬的阻断,同时增加细胞的凋亡。方法1.摸索mR FP-GFP-LC3腺病毒MOI,通过mR FP-GFP-LC3腺病毒转染胶质瘤U87细胞,通过激光共聚焦显微镜观测自噬被MSN-TMZ-PDA-NGR诱导和3-MA阻断现象。2.通过Western blot法检测自噬和凋亡特异性蛋白,验证MSN-TMZ-PDA-NGR诱导胶质瘤自噬发生。流式细胞术和Hoechst染色3-MA检测凋亡,验证自噬抑制的同时是否发生了更强的凋亡。结果1.胶质瘤细胞以最佳MOI成功转染mR FP-GFP-LC3腺病毒,与单独合用TMZ相比,同样药物浓度下MSN-TMZ-PDA-NGR在激光共聚焦显微镜下可见明显更多量的自噬荧光。联合3-MA用药后,自噬被抑制,荧光减少或消失。2.经Western blot法半定量发现,与其他组相比,MSN-TMZ-PDA-NGR导致更明显自噬,在联合3-MA后自噬减弱,导致更明显的凋亡发生。流式细胞术和Hoechst染色实验中,与TMZ组相比,MSN-TMZ-PDA-NGR可导致更明显的凋亡,当联合3-MA治疗后,凋亡现象进一步增加。结论MSN-TMZ-PDA-NGR诱导的自噬可被自噬抑制剂3-MA阻断,导致凋亡的发生或者增加。这为进一步研究两者的联合用药用于体内抗胶质瘤治疗提供了理论依据。第四部分3-甲基腺嘌呤联合NGR修饰的介孔二氧化硅载替莫唑胺治疗胶质瘤的体内研究目的1.建立裸鼠皮下异种移植肿瘤模型。2.利用IVIS(动物活体成像系统)检测MSN-Rh6G-PDA-NGR在体内的分布,评估其靶向性。3.观察各药物制剂对肿瘤重量和生长速度的影响,并评价药物的抗肿瘤效果和生物安全性。方法1.体外培养人胶质瘤细胞U87,选择4W龄裸鼠于前肢腋下皮下注射,建立U87裸鼠皮下异位肿瘤移植模型。2.腹腔注射各种含Rh6G制剂,在动物活体荧光成像系统下观察药物的分布,评估体内靶向性。3.腹腔注射各TMZ的制剂,通过监测肿瘤生长速度,测量肿瘤体积和质量,肿瘤标本Tunel染色,评价各制剂的体内抗肿瘤活性。通过对裸鼠体重监测和主要脏器的HE染色评价制剂的生物安全性。结果1.与对照组和MSN-Rh6G-PDA相比,MSN-Rh6G-PDA-NGR在体内能更明显的积聚于肿瘤区域,荧光定量显示MSN-Rh6G-PDA-NGR组中荧光强度为非靶向组约2.35倍。2.各TMZ制剂处理后,MSN-TMZ-PDA-NGR组肿瘤生长速度和治疗结束后质量明显低于TMZ组和对照组。联合3-MA治疗后,肿瘤生长速度和质量更大的被抑制,Tunel染色显示联合用药组可导致更强的凋亡。各组间裸鼠的体重和重要器官的HE染色并无统计学差异。结论MSN-TMZ-PDA-NGR能靶向作用于体内肿瘤模型,并表现出明显的抗肿瘤活性,联合3-MA可增强抗肿瘤作用,同时具有良好的生物安全性。