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MYC是一个转录因子,隶属于bHLH-LZ家族,其常与Max相互作用形成二聚体靶向特定DNA序列(CACGTG)调控众多基因转录,因其介导了超过30%的肿瘤发生而作为经典癌基因为人们所熟知。大部分肿瘤如卵巢癌、乳腺癌及结肠癌等都存在MYC的基因扩增和异常激活。人类基因组约15%的基因受MYC转录调控,例如E2F2、CDKN1A、CCND1等。MYC通过调控众多基因的转录,在促进血管形成、促进肿瘤发生,以及诱导肿瘤细胞恶性增殖和分化及等方面占据重要地位。最近研究表明,MYC能够调控肿瘤细胞代谢。虽然大量研究解析了 MYC在肿瘤中的生物学功能,也有众多靶基因陆续被发现。但是仍然存在很多机制没有阐明。2015年Nature文章报道MYC介导的肿瘤细胞依赖剪接体生存,MYC与剪接因子BUD31存在合成致死效应,靶向剪接体可有效杀死MYC介导的肿瘤,但是MYC依赖剪接体生存的机制在该文章中并没有阐明。本课题论证了 MYC能够通过转录调控致癌剪接因子的表达促进肿瘤细胞存活。剪接是指pre-mRNA内含子被剪掉,外显子被拼接的过程。其发生在细胞核中,由snRNP识别pre-mRNA剪接位点,经两次转酯反应后得到成熟mRNA。RNA剪接分为组成性剪接和选择性剪接,都由相似的分子机制催化。选择性剪接,即可变剪接,指的是前体mRNA的剪接位点被选择性顺序切割并组合的过程,其通常受RBP(RNA bindingprotein)反式剪接因子调控。这些剪接因子通过靶向特定的Motif序列来影响可变剪接进程,从而扩大人类蛋白质组多样性。与正常组织相比,不仅肿瘤中同一种基因的不同剪接异构体拷贝数有较大差异性,更是有全新的剪接异构体生成。异常剪接作为癌症的一种新标志能够通过产生具有异常增殖特性或抗凋亡特性等利于肿瘤细胞存活特性的剪接异构体参与癌基因激活。课题组通过前期实验及数据库、转录组分析,发现剪接因子PQBP1(Polyglutamine Binding Protein 1)和 SF3B1(Splicing factor 3B subunit 1)在卵巢癌中高表达并且可能受到MYC的转录调控。研究目的本课题主要探究MYC对剪接因子PQBP1和SF3B1的转录调控作用,明确MYC是否通过调控剪接因子而影响其下游剪接事件。研究方法qPCR、Western blotting检测MYC在卵巢癌细胞系中本底表达情况;TCGA数据库、GSE数据库等下载基因数据并进行GO分析、ChIP-seq结果分析等预测MYC对可变剪接事件的影响及寻找下游剪接因子;构建MYC慢病毒敲低和过表达载体,建立相应过表达、敲低稳转卵巢癌细胞系;q-PCR、Western blotting检测PQBP1和SF3B1在MYC过表达、敲低细胞系中变化情况;构建PQBP1、SF3B1wt和mut启动子质粒,Luciferase实验探究MYC对其启动子是否有结合并明确结合位点;平板克隆和CCK-8拯救实验加以验证MYC对二者的调控;利用MYC上游BRD4抑制剂JQ1,处理卵巢癌细胞,探讨PQBP1和SF3B1是否为MYC下游功能性靶基因;qPCR检测初步验证MYC能否通过调控PQBP1和SF3B1而对基因Bcl-x的可变剪接事件产生影响。研究结果1.MYC在卵巢癌中存在拷贝数扩增和过度激活。MYC在34%高级别浆液性卵巢癌存在基因扩增,MYC的高表达与患者预后不良。2.MYC在卵巢癌中对剪接因子PQBP1和SF3B1存在转录激活作用。PQBP1和SF3B1的表达水平在MYC过表达卵巢癌细胞系中显著上调,而敲低细胞系中恰好相反。双荧光素酶报告实验结果显示与突变载体相比,过表达MYC可更加显著增加PQBP1和SF3B1启动子区域的荧光素酶活性。利用BRD4的抑制剂JQ1处理卵巢癌细胞抑制MYC的表达,PQBP1和SF3B1的表达也随之下降,进一步证明了 MYC对PQBP1和SF3B1的调控作用。3.PQBP1和SF3B1参与MYC促卵巢肿瘤增殖过程。在过表达MYC的卵巢癌细胞中分别敲低PQBP1和SF3B1,与敲低前相比,细胞增殖能力有明显减弱。4.MYC通过调控PQBP1和SF3B1转录影响Bcl-x剪接。据报道,PQBP1能够通过SF3B1相互作用,共同影响凋亡相关基因Bcl-x的可变剪接。瞬时转染同等质量浓度的Bcl-x minigene质粒和不同质量浓度的MYC过表达质粒,q-PCR结果显示,随MYC质粒转入量增加,抗凋亡剪接异构体Bcl-xS的RNA水平呈明显下降趋势,而促凋亡剪接异构体Bcl-xL则与其趋势相反。结论1.MYC在卵巢癌中存在拷贝数扩增和过度激活。2.MYC在卵巢癌中对剪接因子PQBP1和SF3B1存在转录激活作用。3.PQBP1和SF3B1参与MYC促卵巢肿瘤增殖过程。4.MYC通过调控PQBP1和SF3B1转录影响Bcl-x的选择性剪接。