类病变突变体(lesion mimic mutants, LMMs)是指一类在没有非生物胁迫或者病原菌侵染时就能自发的形成坏死病斑、从而导致植株防御和抗性基因表达增强的植物突变体。类病变突变体广泛存在于各类植物中,与细胞程序性死亡(programmed cell death. PCD)及植物抗病有着非常紧密的联系且在植物抗逆性、抗病及基因工程等方面有很大的作用和意义。深入了解类病变突变体基因对于了解PCD信号调控网络及植物抗病或抗逆的防御系统的研究有重要的作用。本实验室前期获得两个水稻类病变突变体Z1828与Z1834。Z1828高抗水稻白叶枯病,且对水稻白叶枯病菌的各生理小种具有广谱抗性；Z1834对水稻条纹叶枯病具有较强的抗性。实验室前期己成功定位并克隆了这两个突变体的目标基因,并通过转基因功能互补实验确证了突变体的目标基因,而且对目标基因的功能做了初步研究。本研究主要是分别筛选并验证这两个目标基因的互作基因,然后初步研究互作基因的功能。主要研究结果如下：1、候选互作基因的筛选。通过酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid, YTH)系统分别筛选并获得了突变体Z1828和Z1834目标基因的候选互作基因。对于突变体Z1828,筛选出4个候选互作基因,分别为545、546、664-1及664-2,其中互作基因545、664-1及664-2己被成功克隆。候选互作基因545位于第6号染色体上,包含8个内含子,基因编码序列(coding sequence, CDS)长度为1089 bp,该基因编码一个铁氧还蛋白-NADP还原酶。664-1与664-2为同一基因的不同剪切方式,两种剪切体之间只有12个碱基对的差异,该基因位于第2号染色体上,不同的剪切体均包含6个内含子,664-1的CDS长度为639 bp,664-2的CDS长度为651 bp,该基因编码一个类聚腺苷酸结合蛋白。546位于第4号染色体,包含3个内含子,编码一个细胞色素氧化酶组装蛋白质1；由于基因起始位置不明确,目前尚未克隆到546基因的完成序列。对于突变体Z1834的筛库工作,由于其目标基因片段大,且编码一个抗性蛋白,最初以其完整的CDS序列进行筛库,酵母不能正常生长,这可能是由于外源抗性蛋白对酵母的生长具有抑制作用。因此将该基因的CDS序列分成两段分别进行筛库,最终获得一个候选互作基因1-5,该基因位于第6号染色体,包含7个内含子,其CDS长度为1137 bp,编码一个类线粒体前体甲酸脱氢酶蛋白。2、候选互作基因的验证。对于突变体Z1828目标基因的候选互作基因,我们分别利用双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)和YTH系统对已克隆的3个候选互作基因进行了互作结果的验证,实验结果皆证实目标基因与候选基因互作。通过构建目标基因与互作基因YFP融合表达载体,并通过农杆菌介导转染至烟草细胞表达互作来对其进行BiFC互作验证,结果表明,545与目标基因在细胞外周表达互作,664-1及664-2与目标基因在细胞外周及细胞核均表达互作；通过构建目标基因与互作基因猎物载体与诱饵载体,进行YTH验证,在SD-4固体培养基上,其菌落显蓝且生长状况良好,表现为互作。对于突变体Z1834目标基因的互作基因1-5,经BiFC与YTH验证均无结果。BiFC验证实验中无荧光；YTH验证实验中,在SD-4固体培养基上,菌落只显蓝而生长被抑制,表现为不互作,这可能由多方面原因导致,还需调整实验以进一步进行验证。3、候选互作基因的转基因及突变植株的表型。将3个候选互作基因在突变体Z1828植株中超表达,545的超表达转基因植株出现类病斑的时间较突变体延迟,且叶片上的病斑数量及密度明显少于突变体植株,表现为表型部分恢复；而664-1及664-2的超表达转基因植株有少数出现类病斑时间延迟,但最终病斑爆发与突变体Z1828植株无明显差异,这可能预示着该候选基因的功能处于目标基因调控的上游；未被成功克隆的候选互作基因546的T-DNA插入突变体出现与突变体Z1828植株相似的表型,从植株表型上进一步证明了546为目标基因的互作基因。4、候选互作基因的亚细胞定位。构建了sGFP融合表达载体,对候选互作基因进行了亚细胞定位分析。对于突变体Z1828目标基因的互作基因,545的定位结果较为复杂,出现3种情况,1、只在叶绿体中表达,2、在没有叶绿体的细胞中会在细胞核与细胞外周表达,3、在整个细胞的各个部位都有表达。664-1与664-2的烟草叶片细胞与水稻原生质体细胞的定位略有差异,在水稻原生质体中它们在细胞核及细胞外周均有表达,而在烟草细胞中只在细胞核中表达,这种现象可能是由水稻基因在烟草细胞中的表达差异所导致的。亚细胞定位结果显示,突变体Z1834目标基因的互作基因1-5在除叶绿体外的细胞各部位均有表达。