【摘 要】
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抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物体中普遍存在的一类小分子多肽,它们是机体免疫系统产生的重要效应分子,也是昆虫先天免疫系统的重要组成部分。随着人们对于传统抗生素毒副作用和耐药性的认识,抗菌肽受到越来越多的关注。某些昆虫抗菌肽对动物和植物病原微生物(如细菌、真菌和病毒)具有特殊的抑制或杀灭作用。与传统抗生素相比,抗菌肽具有毒性低和不易产生耐药性的优点。我们从斜纹夜
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抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物体中普遍存在的一类小分子多肽,它们是机体免疫系统产生的重要效应分子,也是昆虫先天免疫系统的重要组成部分。随着人们对于传统抗生素毒副作用和耐药性的认识,抗菌肽受到越来越多的关注。某些昆虫抗菌肽对动物和植物病原微生物(如细菌、真菌和病毒)具有特殊的抑制或杀灭作用。与传统抗生素相比,抗菌肽具有毒性低和不易产生耐药性的优点。我们从斜纹夜蛾的转录本数据中鉴定了一个编码富含脯氨酸类抗菌肽的序列,将其命名为Spodoptera litura Lebocin1(Sl Leb1),并对其开展了研究。首先对Sl Leb1的氨基酸序列进行了分析和联配;其次分析了该基因在斜纹夜蛾中的组织分布和诱导表达规律;最后合成了若干具有潜在抑菌活性的多肽片段,并通过细菌生长抑制实验、凝集实验、扫描电子显微镜、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜和流式细胞分析对抗菌肽段的活性和作用机理进行了初步的研究。主要研究结果如下:(1)Sl Leb1的编码区(CDS)长度为477bp,编码158个氨基酸,其中信号肽包含21个氨基酸,成熟的前体蛋白由氨基酸22至158组成。Sl Leb1的前体蛋白序列中包含3个RXXR基序(RARR,RTAR,RNAR)和高含量的脯氨酸,因此这个前体蛋白可能是被Furin蛋白酶在RXXR基序位置切割成4个短肽。我们将这些短肽分别依照第一个和最后一个氨基酸残基的编号进行命名(22-45,46-88,89-123和124-158),并通过固相合成方法进行多肽合成。(2)通过构建系统进化树发现,Sl Leb1在斜纹夜蛾中有一个旁系同源物,在甜菜夜蛾中有两个直系同源物。将Sl Leb1与烟草天蛾和家蚕的5个Lebocin进行比对,Sl Leb1和烟草天蛾Leb B/C都具有3个RXXR基序,而家蚕Leb1/3/4具有4个RXXR基序。所有序列中的第一个和第二个RXXR基序完全对齐,而烟草天蛾Leb B/C的第三个RXXR基序与Sl Leb1和家蚕Leb1/3/4的位置不同。124-158活性肽段与家蚕、蜜蜂、粉纹夜蛾和银纹夜蛾Lebocin中的活性肽段有一定的相似性,其中4个脯氨酸和1个苯丙氨酸残基是完全保守的。(3)Sl Leb1主要在幼虫的血细胞和中肠中表达,在中肠中的表达水平显著高于血细胞。通过q PCR实验发现,在注射金黄色葡萄球菌3小时后血细胞中的表达水平显著上调,而在注射大肠杆菌和金黄色葡萄球菌3和6小时后中肠中明显下调,在注射大肠杆菌和金黄色葡萄球菌3小时后脂肪体中也呈现显著下调。(4)抑菌结果显示,50μM的124-158小肽对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均具有较强的抗菌活性,而4个短肽(22-45,46-88,89-123和124-158)都显示出对金黄色葡萄球菌的一定抑菌活性,但是没有小肽显示出对粘质沙雷氏菌的活性。扫描电子显微镜结果显示124-158小肽处理的大肠杆菌细胞变得非常长,枯草芽孢杆菌和白僵菌的细胞变的破碎,金黄色葡萄球菌细胞破碎或体积变大。激光共聚焦结果显示荧光标记的124-158小肽可能定位在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和粘质沙雷氏菌的表面或内部,而明显定位在白僵菌孢子的表面。负染和透射电子显微镜的结果表明124-158小肽造成了大肠杆菌细胞膜破裂和内容物泄漏。(5)为了进一步研究124-158活性小肽的功能,我们在124-158的基础上进一步合成了4个更短的肽段,它们分别在N末端(127-158,135-158)或C末端(124-155,124-149)缺少一些氨基酸残基,然后开展了抑菌、凝集和流式细胞分析。抑菌实验结果显示,124-149肽段具有最高的抑菌活性。凝集结果显示,只有124-158和127-158肽段能够凝集细菌和白僵菌孢子。流式细胞分析结果显示,经过小肽处理,金黄色葡萄球菌的细胞群分布发生了明显变化,即具有更大直径或更复杂表面特征的细胞增多,而且含有更高DNA含量的细胞也相应增多。本研究有助于增加我们对富含脯氨酸类抗菌肽的了解,为进一步研究鳞翅目Lebocin家族抗菌肽的抑菌机理奠定了基础。
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