【摘 要】
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真菌毒素是广泛存在于谷物和其他食品中的真菌次级代谢产物,对人类和动物健康会造成严重危害。作为典型的真菌毒素,黄曲霉毒素B1（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEA）由于其强毒性作用而备受关注。已有研究表明:氧化应激在AFB1的产生和ZEA导致的细胞毒性机制中均扮演着重要作用。因此,活性氧（ROS）实时监测对于真菌产生AFB1以及ZEA致细胞毒性机制分析至关重要。但是,由于ROS半衰期短,检测困难,现阶段
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真菌毒素是广泛存在于谷物和其他食品中的真菌次级代谢产物,对人类和动物健康会造成严重危害。作为典型的真菌毒素,黄曲霉毒素B1（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEA）由于其强毒性作用而备受关注。已有研究表明:氧化应激在AFB1的产生和ZEA导致的细胞毒性机制中均扮演着重要作用。因此,活性氧（ROS）实时监测对于真菌产生AFB1以及ZEA致细胞毒性机制分析至关重要。但是,由于ROS半衰期短,检测困难,现阶段关于ROS参与上述机制的研究尚十分缺乏。电化学生物传感器具有选择性好、灵敏度高、操作简单等优点,已用于多种生物标志物的检测。因此,本研究拟开发ROS电化学传感器,探究AFB1产生和ZEA致细胞毒性过程中氧化应激系统的变化规律,进而揭示ROS参与AFB1产生和ZEA细胞毒性的相关机制。具体如下:1.H2O2电化学传感器的构建及其在真菌CAT-AFB1相关性研究中的应用ROS是AFB1产生的先决条件,过氧化氢酶（CAT）是调节胞内ROS水平的重要酶类。因此,CAT可能直接或间接参与真菌AFB1的生成。本研究以钯纳米颗粒/碳化细菌纤维素（Pd NPs/CBC）为催化材料,构建了H2O2电化学传感器,将其用于黄曲霉菌生长过程中CAT活性变化的监测,并进一步对CAT活性和AFB1产生的相关性进行了研究。基于Pd NPs/CBC的传感器能在0.5～3.5 U/m L（R~2=0.98）范围内监测CAT活性,检测限为0.434 U/m L,灵敏度和检测范围均优于常规的紫外分光光度法。黄曲霉菌粗酶提取物CAT总活力随培养时间的延长呈线性增加,但考虑到生物量的贡献,用总CAT活力除以菌丝干重计算CAT的比活力。结果表明,前3天CAT比活力没有发生明显的变化,酶活力维持在～25U/mg,但在第4天和第5天CAT比活力迅速增强,分别达到28.91和45.30 U/mg。在霉菌培养期间AFB1的产生也呈现出同样的趋势。前3天AFB1增加缓慢,毒素产量仅由第1天的40.05 ng/m L增长到76.40 ng/m L,培养至第4天和第5天,AFB1的产量分别达201.35和767.90 ng/m L。由此可以得出结论,特定单位质量黄曲霉的CAT活力可能与AFB1的产生密切相关,在食物贮藏过程中CAT的比活力有潜力作为AFB1产生的新指标。2.O2·-电化学传感器在ZEA致细胞毒物兴奋效应机理研究中的应用ZEA具有多种毒性作用,如肝毒性、血毒性、免疫毒性和遗传毒性等,但ZEA致细胞毒性的确切机制尚未明确。已有研究表明氧化应激可能是ZEA细胞毒性的可能机制。因此,本研究以羧甲基纤维素-磷酸锰（CMC-Mn3（PO4）2）为催化材料,构建了一种便携式O2·-电化学传感器,并将其用于ROS介导ZEA细胞毒物兴奋效应（hormesis）机理的研究。该O2·-电化学传感器的检测范围为57.5 n M～2.95μM（R~2=0.99）,灵敏度为78.67μAμM-1 cm-2,检测限为8.47 n M,完全可满足后续活细胞O2·-检测的需求。研究表明:ZEA瞬时刺激会引起O2·-的释放,胞内ROS降低,从而导致毒物兴奋效应。随后,继续探究了ZEA瞬时刺激后细胞的修复过程。经1 h修复后,实验组的电流响应值达1211 n A,远高于空白对照组（707 n A）,表明胞内O2·-得到过量补充,同时毒物兴奋效应消失;继续修复至2 h,实验组电流值（878 n A）仍高于对照组（686 n A）,但是二者胞内O2·-浓度的差距在缩小;直到修复时间达4 h,实验组和对照组的电流值维持在～780 n A,提示实验组胞内O2·-修复完成。因此,ZEA瞬时刺激可能引起了氧化应激,导致毒物兴奋效应出现;ZEA及时移除,兴奋效应消失,胞内O2·-随着细胞生长不断调节,并恢复到正常水平。上述研究结果证实,氧化应激可能在ZEA细胞毒性机制中起重要作用。本论文构建了两种不同的电化学传感器——H2O2传感器和O2·-传感器,并分别用于黄曲霉中CAT活性和细胞内外O2·-的监测。本论文不仅拓展了电化学传感器在食品加工及食品安全研究领域的应用,而且揭示了CAT活性-AFB1产生的相关性以及ZEA毒物兴奋效应的可能机制,有望为真菌产毒与致毒研究提供新的手段和思路。
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