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研究背景:肝细胞癌（以下简称肝癌）,是我国目前普遍的恶性肿瘤之一。其中90%以上患者的肝癌与乙型肝炎相关。以手术切除为主,经动脉化疗栓塞,射频消融等为辅的治疗方法虽然对患者的预后有所帮助,但对晚期肝癌并无显著疗效。因此,探索肝癌的发生发展机制,寻找肝癌治疗的新靶点,对于提高肝癌患者生存率至关重要。由于无限制增殖以及血管生成异常,包括肝癌在内的实体肿瘤内部普遍缺氧。HIF1α是缺氧诱导因子HIF1的关键亚基,在缺氧时稳定,参与调控肿瘤干性相关基因的表达。泛素特异性肽酶USP22在前期研究中被认为是肿瘤干性标志物,本研究团队前期已发现USP22可通过促进MRP1表达调控肝癌细胞对化疗药物耐药。TP53作为最重要的抑癌基因之一,在乙肝相关肝癌患者中突变频率高。本研究发现USP22在缺氧条件下促进HIF1α的表达;而HIF-1α在TP53基因突变时可反向促进USP22的转录表达水平。因此,本项目研究在缺氧条件下USP22/HIF1α对肝癌耐药、转移、成瘤等干性表型的影响,阐明在分子层面USP22与HIF1α的相互调节机制,评估在肝癌组织标本中USP22/HIF1α的表达状态及关联性,验证USP22/HIF1α可作为靶向肝癌干性治疗的关键靶点。研究目的1.明确USP22在缺氧条件下促进肝癌细胞干性表型。2.探究USP22在缺氧条件下通过HIF1α促进肝癌细胞干性表型的具体机制。3.探索USP22/HIF1α在肝癌中的临床意义以及作为治疗靶点的有效性。研究方法1.通过慢病毒构建降低USP22表达或过表达USP22的肝癌细胞系;通过对肝癌细胞样本的测序分析,证明USP22在缺氧情况下对干性相关基因的表达有促进作用;通过对细胞增殖、细胞成球,迁移,对索拉菲尼耐药能力,干性相关表面标志物,体内极限稀释成瘤等实验探究USP22变化后肝癌细胞干性的变化。2.通过western blot和双荧光素报告酶系统测定肝癌细胞降低USP22表达后或过表达USP22后,HIF1α蛋白水平及转录活性的变化;通过构建USP22和HIF1α突变质粒,应用western blot、免疫共沉淀技术及免疫荧光共聚焦扫描等技术,明确USP22和HIF1α的结合位点,结合位置及调控方式。3.通过免疫组化测定并分析262例肝癌临床样本中的USP22及HIF1α的表达相关性;通过TCGA等数据库分析325例肝癌患者中,USP22、HIF1α的表达高低及TP53突变情况对患者生存预后影响;利用纳米材料靶向USP22,联合小分子抑制剂索拉菲尼在荷瘤裸鼠中分组治疗,观察各组的治疗效果及体重变化并利用免疫组化技术分析瘤中USP22,HIF1α蛋白表达变化。结果1.在缺氧条件下,体外实验中,USP22可促进干性相关基因的表达同时促进肝癌细胞增殖,成球,迁移,对索拉菲尼的耐药以及干性相关表面标志物的表达;体内实验中,USP22促进肝癌细胞的成瘤能力。2.下调肝癌细胞中的USP22基因表达,HIF1α蛋白的表达及转录活性随之降低,过表达USP22则促进HIF1α的蛋白表达及转录活性。USP22通过C19肽酶结构域和HIF1α结合,免疫荧光测定两者的共定位信号位于细胞核。在TP53突变的肝癌细胞中,HIF1α促进USP22的m RNA水平和蛋白水平。在TP53野生型的细胞中敲除TP53,HIF1α对USP22转录调控功能恢复。3.USP22在肝癌中的表达和HIF1α正相关;USP22和HIF1α高表达且TP53突变的患者临床预后极差;针对USP22为靶点的纳米药物FLPP-sh USP22在TP53野生型肝癌荷瘤小鼠中体现良好的抑瘤效果,联合小分子抑制剂索拉菲尼的治疗方案在TP53突变型肝癌荷瘤小鼠中同样体现良好的抑瘤效果。结论1.USP22在缺氧条件下促进肝癌细胞干性。2.USP22抑制HIF1α蛋白的泛素化,稳定HIF1α的蛋白以及促进其转录活性;USP22通过C19肽酶结构域和HIF1α结合于细胞核;基于TP53失活,HIF1α正反馈促进USP22的转录。3.USP22及HIF1α高表达结合TP53突变与肝癌患者的不良预后密切相关;针对USP22为靶点的纳米治疗展现良好的抑瘤作用。