目的:通过定点突变技术得到保守基序的各种突变体（p201/a、p20s₁/a、p20k/a、p20i/a、p20v₁/a、p20v₂/a）,并通过Western blotting探讨保守基序中各氨基酸对大鼠粘蛋白rMuc3蛋白酶切的影响。方法:1、采用定点突变技术,设计相应突变引物,以p20为模板,基于PCR扩增得到突变体,并经测序验证。2、用质粒中量提取试剂盒得到足量的质粒,然后利用阳离子脂质体LipofectAMINE将各突变体及p20转染入COS-7细胞中。3、通过Western blotting检测各突变体的表达,采用Quantity one分析各种突变体未酶切和酶切部分的表达强度,并分析未酶切部分所占比例。结果:1、使用PCR定点突变的方法,获得突变体,经序列测定后利用clustalx1.83软件与模板p20比对,证实突变完全成功。并通过质粒中量提取获得了足量的质粒用于转染。2、裂解细胞后将细胞裂解物进行Western blotting免疫印迹实验,证实在55kDa处存在未酶切的部分,在30kDa处存在可被抗V5抗体检测的N端部分,经过Quantityone分析后发现,S₂/A完全抑制了酶切的发生,G/A抑制了绝大部分的酶切（未酶切部分占79%）,L/A、I/A、V₁/A、V₂/A均对酶切产生了不同程度的抑制,未酶切部分分别为22%、39%、14%和17%,而K/A和S₁/A几乎对酶切没有影响,其未酶切部分分别为6%和3%,酶切效率与p20（未酶切部分占4%）几乎一样。结论:以p20为模板的各种突变体突变成功,以脂质体转染法将所有突变体导入COS-7细胞并获得了相应突变体的高效表达。通过Western blotting免疫印迹实验结果揭示了酶切保守基序LS₁KGS₂IV₁V₂中各氨基酸对其蛋白酶切的发生是很重要的,其机理可能是因为此保守基序位于β2和β3片层之间的环状区,其上的氨基酸对于维持粘蛋白的构象是必须的。在S₁上可能有O型糖链的存在,并且去除此O型糖链不影响酶切保守基序LS₁KGS₂IV₁V₂的酶切。