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目的:苯并芘（Benzopyrene,B（a）P）是多环芳烃类的代表性化合物,属于内分泌干扰物,具有卵巢毒性。课题组前期实验结果显示,B（a）P会影响妊娠早期胚胎植入及蜕膜化过程,而这些过程都受到卵巢颗粒细胞合成与分泌雌激素及孕激素的调控。但目前关于B（a）P对妊娠早期卵巢毒性的机制还知之甚少。本研究探索了B（a）P对妊娠早期卵巢功能的影响及其具体的毒性机制。方法:1、建立B（a）P染毒孕鼠模型:将查得阴栓的雌性小鼠随机分为对照组和B（a）P染毒组,并记为孕“D1”天。B（a）P组从孕D1至D7天,每日晨灌胃给予0.2mg/kg浓度B（a）P;对照组则从孕D1至D7天,每日晨以0.1m L/10g动物体重灌胃给予玉米油。分别于孕D4和D7天收集血清及卵巢材料。2、建立BPDE染毒细胞模型:将人卵巢颗粒细胞系KGN分为对照组、h CG组和BPDE组。对照组加入溶剂DMSO。h CG组:加入1.0IU/m L h CG处理24h,诱导KGN细胞发生黄体化。BPDE组:使用BPDE（0.5μmol/L）联合h CG（1.0 IU/m L）处理人卵巢颗粒细胞系KGN 24h。其中,BPDE为B（a）P在体内的主要代谢产物。3、建立氧化应激阳性对照细胞模型:首先使用h CG（1.0 IU/m L）诱导KGN细胞发生黄体化20h,再使用不同浓度H2O2联合h CG共同处理4h。4、建立NAC挽救实验细胞模型:提前2h使用5m M NAC预处理KGN细胞,然后联合使用h CG（1.0 IU/m L）和BPDE（0.5μmol/L）或H2O2（50μM）进行染毒。5、建立TRAF2过表达细胞模型:构建过表达质粒载体（pc DNA3.1（+）-vector和pc DNA3.1（+）-TRAF2）,分别使用两质粒转染KGN细胞72h。6、建立Bet A激动剂细胞模型:使用Bet A（1μM）联合h CG（1.0IU/m L）和BPDE（0.5μmol/L）处理KGN细胞24h。7、建立VX-765抑制剂细胞模型:使用VX-765（5μM）联合h CG（1.0 IU/m L）和BPDE（0.5μmol/L）处理KGN细胞24h。材料收集完毕后,进行以下实验:（1）ELISA法检测早孕小鼠血清内E2、P4水平,RT-q PCR法检测小鼠卵巢组织及KGN细胞中雌孕激素合成限速酶3β-HSD、17β-HSD和P450scc m RNA水平。（2）RT-q PCR法检测早孕小鼠卵巢组织及KGN细胞中氧化应激指标CAT、SOD2 m RNA水平,CM-H2DCFDA检测ROS水平。（3）ELISA和RT-q PCR法检测早孕小鼠卵巢组织及KGN细胞中炎症因子IL-18、IL-1β和TNFα水平。（4）Western blot和IF法检测早孕小鼠卵巢组织及KGN细胞中细胞焦亡相关蛋白表达情况。（5）TUNEL法直接观察早孕小鼠卵巢组织及KGN细胞凋亡情况。（6）RT-q PCR、Western blot和IF法检测早孕小鼠卵巢组织及KGN细胞中TRAF2的表达。利用pc DNA3.1（+）-TRAF2质粒构建TRAF2过表达细胞模型,观察TRAF2在BPDE致卵巢毒性中的作用。（7）分离早孕小鼠卵巢组织及KGN细胞中细胞核、质蛋白,Western blot法检测NFκB信号通路相关蛋白表达。IF法检测KGN细胞中NFκB蛋白表达。使用NFκB激动剂Bet A处理后,观察黄体化KGN细胞中NFκB对BPDE卵巢毒性的影响。（8）Western blot法检测早孕小鼠卵巢组织及KGN细胞中Caspase1和t BID的表达。使用Caspase 1抑制剂VX-765处理后,观察黄体化KGN细胞中促凋亡基因t BID的表达。（9）使用抗氧化剂NAC处理BPDE及H2O2染毒细胞模型,观察NAC对黄体化卵巢颗粒细胞功能恢复的影响。结果:1、B（a）P降低妊娠早期小鼠血清雌激素及孕激素水平。B（a）P及其代谢产物BPDE会抑制雌孕激素合成限速酶3β-HSD、17β-HSD和P450scc m RNA水平。2、B（a）P及BPDE下调抗氧化酶CAT、SOD2 m RNA水平,促进ROS的生成,增强氧化应激。H2O2阳性细胞模型中观察到相似的结果。使用NAC联合处理能挽救BPDE（或H2O2）所导致的氧化应激增强。3、B（a）P及BPDE促进炎症因子IL-18、IL-1β和TNFα的释放,造成炎症反应。H2O2阳性细胞模型中也观察到炎症反应的发生。使用NAC联合处理能抑制BPDE（或H2O2）所诱导的炎症反应。4、B（a）P及BPDE上调了早孕小鼠卵巢组织及黄体化KGN细胞中NLRP3及Cleaved-Caspase1的表达,诱导细胞凋亡,但焦亡关键蛋白GSDMD-N未明显上调。5、B（a）P及BPDE抑制小鼠卵巢组织及黄体化KGN细胞中TRAF2的表达。NAC能缓解BPDE（或H2O2）对TRAF2表达的抑制作用。过表达TRAF2能减弱BPDE所导致的黄体化KGN细胞凋亡和雌孕激素合成限速酶基因表达下调。6、B（a）P及BPDE抑制小鼠卵巢及黄体化KGN细胞中IκB磷酸化,阻止NFκB信号进入细胞核。使用NFκB激动剂Bet A及过表达TRAF2能部分恢复BPDE所导致的KGN细胞凋亡和雌孕激素合成限速酶基因表达下调。7、B（a）P及BPDE激活小鼠卵巢及黄体化KGN细胞中Caspase 1,上调促凋亡基因t BID表达。过表达TRAF2及使用NFκB激动剂Bet A能抑制Caspase 1的激活。使用Caspase 1抑制剂VX-765能降低BPDE所导致的t BID表达上调。结论:B（a）P及代谢产物BPDE会增强氧化应激,诱导炎症反应发生,并通过TRAF2-NFκB-Caspase 1轴促进线粒体内促凋亡基因BID剪切,导致细胞凋亡,抑制妊娠早期卵巢雌孕激素合成与分泌。