RNA干扰抑制ACP1对前列腺癌T3B细胞的影响

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目的构建包含有ACP1小干扰RNA序列的真核表达载体,并将构建的载体转染入前列腺癌T3B细胞中,检测ACP1在pGenesil-1/ACP1-shRNA转染的T3B中的表达,研究ACP1基因被下调后,前列腺癌T3B细胞的生物学特性变化。方法针对人ACP1基因开放阅读框序列选择干扰目的片段,据干扰目的片段设计小发卡状RNA序列,人工合成设计好的片段,将合成片段与pGenesil-1质粒连接,构成克隆质粒。将重组的质粒转化入大肠杆菌DH5-α,进行扩增,经纯化、酶切、测序鉴定插入片段完整正确。用脂质体介导的基因转染技术将pGenesil-1/ACP1-shRNA质粒转染入T3B细胞,G418筛选得到稳定克隆,以RT-PCR方法在mRNA水平检测ACP1表达,以Western Blot方法检测蛋白水平的表达。将细胞分为PC-3组、T3B组、pGenesil-1转染组、pGenesil-1/ACP1-shRNA转染组,通过MTT法测生长曲线,流式细胞术测细胞周期和凋亡,粘附实验测粘附能力,划痕实验测迁移能力,Transwell法测侵袭能力。结果成功构建了人ACP1-shRNA真核表达载体。筛选到成功转染,并能稳定表达的单克隆株,与对照组比较mRNA由0.45±0.03下降到0.09±0.02,蛋白相对表达由0.65±0.02下降到0.21±0.03,mRNA下调80%,蛋白下调76%,与对照组相比,下调ACP1后,前列腺癌细胞生长及细胞周期无明显变化,粘附能力明显下降,迁移能力和侵袭能力皆下降。结论经shRNA对ACP1进行下调,可见ACP1在mRNA和蛋白水平均表达均得到有效抑制,ACP1下调后前列腺癌细胞的粘附、迁移、侵袭能力,对增殖无影响。
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