目的:恶性肿瘤是一种世界范围内的公共卫生问题,而肺癌作为目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,已经严重危害人类的健康,因此寻找有效的预防标志物和治疗靶点,从而提高肺癌患者的生存率和生存质量具有重要的研究意义和实际应用价值。化学药物治疗是作为肿瘤患者术后辅助治疗的一种主要手段,针对肺癌患者的化疗主要是以铂类药物为基础,顺铂（cis-dichlorodiamine platinum,cisplatin,CDDP）是一种广泛应用在临床上的一线铂类药物,其主要作用靶点是肿瘤细胞的基因组DNA。尽管目前对肺癌的化学治疗取得了一定的进展,但是由于肿瘤细胞的耐药问题,顺铂类化疗药物的应用并未使肺癌患者的5年生存率得到明显提高。DNA损伤修复功能是影响细胞对顺铂产生耐药性的主要机制之一,DNA损伤修复功能异常的增强会使肿瘤细胞对化疗药产生拮抗,甚至导致化疗失败。DNA损伤修复系统会对受损伤的DNA进行修复,在保持细胞基因组稳定性中发挥关键作用。核苷酸切除修复系统（nucleotide excision repair,NER）是最重要而灵活的一种与耐药相关的DNA损伤修复机制,对顺铂等铂类药物引起的铂-DNA加合物发挥主要的切除修复作用。切除修复交叉互补基因1（excision repair cross-complementation group 1,ERCC1）是一种高度保守的核酸内切酶,在NER中起到限速和调解的重要作用。ERCC1常常在肿瘤易感和治疗的不同阶段被作为关键分子标志用于预测肿瘤的发生风险及预后结局。以往研究表明ERCC1基因的表达水平在肺癌中对于以顺铂为基础的术后辅助化疗具有预测疗效和生存率的潜在价值。然而,尽管已经获得ERCC1作为生物标志预测顺铂治疗肺癌预后效果的直接或间接证据,但众多研究结论尚未得到统一,相关机制有待阐明。mRNA的选择性剪接（Alternative Splicing,AS）作为真核生物转录组和蛋白质组多样性的主要来源,在细胞分化、发育等过程中发挥重要的基因表达调控作用。同一个基因在不同细胞和组织具有不同的可变剪接模式。选择性剪接的可塑性常常被癌细胞利用,从而产生促进癌细胞存活、增殖、转移和耐药性的亚型。在人类肿瘤细胞基因剪接异构体的表达与肿瘤进展相关。在肺癌组织和细胞系中,ERCC1不同的剪接异构体会同时表达,因此鉴别各个亚型与铂-DNA加合物修复相关的功能显得尤为重要。剪接异构体ERCC1-202与ERCC1-208具有相同的CDS区,其翻译的297aa蛋白质产物是唯一具有DNA损伤切除修复功能,不同的是ERCC1-202具有全长3’UTR。3’UTR是基因的重要功能元件,在基因表达调控中发挥重要作用,而其一级结构或二级结构的改变可以影响一个或多个基因的表达。全基因组关联研究GWAS及经典流行病学调查研究发现人染色体l9q13与肿瘤遗传易感及预后治疗相关,这一区域突变可以影响细胞的修复、增殖和凋亡,与肿瘤的发生发展及预后转归相关。ERCC1、CD3EAP、PPP1R13L共同位于人染色体l9q13,其中ERCC1参与细胞对环境致癌因子所致DNA加合物的核苷酸切除修复系统。CD3EAP是RNA聚合酶I的亚单位,参与细胞增殖。PPP1R13L是确切的TP53抑制剂,对T P53介导的细胞凋亡具有重要调控作用。ERCC1-202的3’UTR末端位于PPP1R13L同一链上游,距离不足1KB,同时,CD3EAP位于互补链。ERCC1-202与CD3EAP的3’端重叠,CD3EAP与PPP1R13L在各自5’端的转录起始位置相互重叠,形成反向重叠基因构象。这一区域基因独特的空间关系及其鲜明的功能特点在对外界基因毒有害因子刺激下细胞的命运转归可能具有重要的意义。与以往研究3’UTR对基因转录后调控机制的影响不同,本研究通过生物信息学和实验验证相结合的方法,着重研究ERCC1基因3’UTR在转录水平上对邻近基因表达的影响。探索肺癌中ERCC1基因可变剪接所致的个体差异与顺铂耐药之间的关联。肺癌细胞的顺铂耐药机制是由多种通路共同参与的,任何一种机制都不可能充分地解释耐药发生的全过程。目前临床应用中ERCC1还不足以作为预测化疗疗效和预后生存率的有效生物标志物,因此,有必要对肺癌的顺铂耐药机制做进一步的深入研究,为ERCC1这一生物标志物的精确应用给出新的提示线索。方法:1、首先本研究从2017年8月至2017年12月共收集来自辽宁省肿瘤医院初次确诊为肺癌患者的病例20例,术中采集候选NSCLC患者的癌组织及其癌旁组织,进行肿瘤细胞的原代培养,应用MTT法进行顺铂药敏实验;同时提取癌组织及癌旁组织中的总RNA,通过实时定量PCR检测ERCC1mRNA总体表达量和ERCC1-202 mRNA的表达量,分析ERCC1 3’UTR可变剪接与顺铂敏感性之间的关联。其次,构建两种ERCC1可变剪接异构体ERCC1-202与ERCC1-208的过表达载体,转染肺腺癌细胞A549和工具细胞293T,构建转染细胞系,Western blotting检测3’UTR可变剪接对ERCC1自身蛋白质表达的影响,CCK8细胞抑制率实验、γH2AX免疫荧光实验比较可变剪接异构体ERCC1-202与ERCC1-208对顺铂所致DNA损伤修复中的功能差异。2、生物信息学数据库提供了丰富的癌症数据资源,本研究利用多种生物信息数据库对ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因重叠区域进行特征性结构分析和表观遗传学调控模式分析,预测双向启动子所在的基因组区域,通过构建双向启动子验证质粒转染293T细胞进行验证。同时获取TCGA癌症基因组数据库和GEO数据库中肺癌相关的转录本表达数据,分析ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因表达的相关关系,加深对ERCC1-202的转录过程与下游重叠基因转录调控网络相互作用的理解,进而为研究顺铂耐药的生物学机制提供线索。3、应用顺铂处理16HBE、A549及LK2建立DNA损伤细胞模型,利用Affymetrix全转录芯片检测不同细胞系在给予顺铂处理24h后,ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因转录本的变化。在分析全转录本芯片数据的基础上,利用3’RACE与Real time-PCR相结合的方法对ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因3’端长度和表达量进行检测。结果:1、肺癌组织样本顺铂药敏实验分析表明,ERCC1-202的mRNA在癌旁组织中高表达,在肿瘤组织中低表达;并与顺铂敏感性(IC50)具有较强的正相关关系（P＜0.05）。提示ERCC1基因的3’UTR可变剪接在DNA修复所致的顺铂药物敏感性个体差异中具有重要的作用。通过构建有无ERCC13’UTR两种剪接异构体的过表达质粒,分别转染靶细胞A549和工具细胞HEK293T细胞,给予不同浓度顺铂处理后,两种过表达转染细胞的细胞存活率及DNA损伤修复没有显著的统计学差异,提示ERCC1基因3’UTR可变剪接可能对自身蛋白质功能没有影响。2、UCSC数据库对基因特征性结构分析显示,多个CpG岛位于ERCC1-202转录本的转录终止位点附近。CD3EAP和PPP1R13L重叠区域CpG岛附近存在H3K27乙酰化和H3K4三甲基化峰,而这通常是代表转录活性调控元件,有利于DNA解开双螺旋。这表明CD3EAP和PPP1R13L基因重叠区域是一个转录激活结构域,可能受到双向启动子的转录调控。DBTSS数据库分析显示,CD3EAP基因与PPP1R113L基因在多种组织和细胞系中有双向转录起始信号。支持CD3EAP与PPP1R113L基因间的双向启动子假设。下载GEO数据库肺癌相关分析的芯片数据,分离出ERCC1基因不同探针集的表达信号,与下游CD3EAP和PPP1R13L的3’端探针集的表达进行相关性分析。结果显示ERCC1-202与PPP1R13L的3’端表达量在多个数据集中正相关。ERCC1-202与CD3EAP的3’端在鳞癌中显著正相关。CD3EAP的3’端与PPP1R13L的3’端显著正相关,并在鳞癌中相关性最强,提示存在双向转录。利用R3.3.3下载TCGA数据库测序数据在肺癌肿瘤组织和癌旁组织中准确描绘ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L差异表达的外显子。结果显示ERCC1的第11外显子在肺癌组织和癌旁组织之间存在显著差异表达,肺癌组织中的ERCC1-208表达量较高。基因水平的转录相关分析表明CD3EAP与PPP1R13L基因表达在癌旁组织和肿瘤组织中均显著正相关。而ERCC1与CD3EAP只在肿瘤组织中显著正相关。外显子水平的转录相关分析表明,CD3EAP基因第一外显子与PPP1R13L第一外显子表达显著正相关。进一步说明CD3EAP与PPP1R13L基因之间可能存在双向启动子的转录激活区域。将CD3EAP与PPP1R13L重叠区双向启动子预测位点附近序列构建体外表达载体,进行双向启动子验证,结果可见双向荧光蛋白表达。研究表明共表达基因之间往往也存在蛋白质层面的功能相关,STRING蛋白质相互作用网络的生物信息学分析表明,CD3EAP和ERCC1可以与TBP直接结合,PPP1R13L也通过SP1的间接作用与转录起始复合物结合。ERCC1、CD3EAP、PPP1R13L各自具有鲜明的功能特点,参与不同细胞通路,但在转录起始过程中却又功能相关,这提示三个重叠基因可能共同参与了某种细胞通路来发挥功能。3、经顺铂处理16HBE、A549及LK2细胞建立DNA损伤的细胞模型,发现A549与16HBE细胞对顺铂敏感性不同,并且细胞死亡方式也有较大差异。利用Affymetrix全转录芯片检测不同细胞系在给予顺铂处理后,ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因转录本的变化。结果表明A549中ERCC1-208表达量升高,而16HBE细胞中ERCC1-202的表达量升高,并存在CD3EAP与PPP1R13L第一外显子表达量的共同升高。尽管芯片数据具有非常高的参考价值,但更清晰的基因3’UTR数据通常需要通过RACE方法得到。在本研究中,我们在分析全转录本芯片数据的基础上,利用3’RACE与Real time-PCR结合的方法对ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因的3’UTR的长度和表达量进行了精确测定。ERCC1-202的3’末端与CD3EAP和PPP1R13L基因的3’末端在给予顺铂处理后表达量共同升高,结果提示ERCC1-202引起下游重叠基因共表达的模式可能影响细胞的死亡方式和对顺铂的敏感性。结论:1、肺癌临床标本分子特征分析提示包含3’UTR的ERCC1可变剪接体ERCC1-202在癌旁组织中高表达,并与顺铂敏感性相关联,表达越高,敏感性越差。但体外转染试验提示ERCC1基因3’UTR对自身蛋白质功能没有影响。2、ERCC1的下游重叠基因CD3EAP与PPP1R13L呈分离型重叠模式,通过共用双向启动子相互促进转录,在转录水平呈显著相关性。CD3EAP与PPP1R13L基因之间存在具有双向启动子功能的转录激活区域。3、ERCC1-202可变剪接体的表达可以激活下游双向启动子,使重叠基因CD3EAP与PPP1R13L通过共转录的模式影响细胞对顺铂的敏感性。转录过程存在时空特异性,ERCC1-202表达会在转录水平对下游基因的转录产生影响,甚至起到转录开关的作用,将三个基因的转录过程连接成为一个由特殊的空间关系产生的整体表达模式,实现基因各自所在功能网络的协作。4、研究ERCC1、CD3EAP、PPP1R13L重叠基因的转录调控模式,对于阐明细胞在顺铂所致DNA损伤后不同的命运转归这种复杂调控机制是至关重要的。共享表观遗传修饰或许是基因共表达模式的一个潜在的机制,这种转录调控模式可能被用作肺癌生物标记,用于预测肺癌患者对铂类化学治疗的反应。在攻读博士学位期间,除了上述对ERCC1基因3’UTR可变剪接及其对下游重叠基因表达影响的系统研究之外,还对ERCC1基因5’端的反向重叠基因FOSB做了初步的探索性分析,以期评价其可变剪接的特征及差异表达作为非小细胞肺癌生物标志的可能性。故在本文的第四部分记录了这部分工作内容。首先进行生物信息学研究:应用TCGA数据库,对FOSB与ERCC1基因表达量之间进行相关分析;比较非小细胞肺癌组织及癌旁组织之间FOSB的差异表达及其对肺癌患者预后生存率的影响;其次进行实验研究:收集肺癌病例的临床标本,检测癌组织和癌旁组织FOSB基因mRNA和蛋白表达。结果表明,FOSB基因的mRNA表达水平在癌旁组织中显著高于癌组织,FOSB基因mRNA的表达在预测肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）患者生存率中具有不同的意义,FOSB在LUAD表达越高提示预后生存期越长,而在LUSC中则相反,差异具有统计学意义（P＜0.05）。FOSB基因第二外显子存在多种可变剪接形式。FOSB基因mRNA与其蛋白表达不一致。初步分析表明FOSB基因可能在肺癌的发生和发展中具有重要作用,具有作为肺癌生物标志物或治疗靶标的潜在价值,但深入机制研究尚需进一步证实。