论文部分内容阅读
蝎子被认为是活化石,在地球上生活了4亿多年而没有显著的形态变化。蝎子完全依靠其尾部毒腺里的毒素多肽来捕获猎物和保护自己。在漫长期的进化过程中,为适应不断变化的环境,维持其生存,蝎子已形成多种不同的毒素多肽。蝎毒素主要是一类20-98个氨基酸构成的小分子多肽,一般含有3或4对二硫键,可能选择性、特异性地与细胞膜上的离子通道（Na+N道、K+通道、Cl-通道和Ca2+通道）相结合,影响离子通道的状态,是研究离子通道的分子探针。由于蝎毒素是一种小分子多肽,结构简单、功能特异性强,但其种类繁多、进化史渊长和功能复杂。所以蝎毒素是基因组研究基因结构与功能关系很好的材料,也是研究分子进化的模式材料。本课题根据从东亚钳蝎Mesobuthus martensii Karsch和亚洲雨林蝎leterometrus spinifer的cDNA文库中,筛选出7个新的蝎毒素多肽（分别命名为：BmKBy、MmKTx1、HsAp、 HsAp2、HsAp3、HsAp4和HsVxl）,分别根据其cDNA的全长序列设计引物,克隆得到8个基因：BmKBTa、BmKBTb、BmKBy、HsAp、HsAp2、HsAp3、HsAp4和HsVxl.通过研究这些蝎毒素结构、功能和进化的相互关系,以及分析这些蝎毒素对蝎子适应环境的意义,我们获得以下主要结果：1、从东亚钳蝎中克隆并测序得到一个新的编码类BmKBT多肽（BmKBy）的cDNA序列。功能分析表明,BmKBT和BmKBy对BALB/c鼠具有比较强的毒性,而对于棉铃虫的毒性非常弱。系统进化分析表明,BmKBT和BmKBy是a和b毒素的进化中间型。我们也获得了BmKBT和BmKBy的基因组序列,发现基因组中内含子的大小存在巨大的差异,其中编码多肽BmKBT的两个基因（BmKBTa和BmKBTb）分别含有1529bp和225bp的内含子；编码多肽BmKBy的基因含有1312bp的内含子。在应对不同环境的刺激下,含有长的内含子的基因有利于组成型表达,而含有短的内含子的基因快速表达,这为BmKBTa和BmKBTb毒素多肽的组成型表达或快速生成提供了理论基础,对蝎子适应不同环境具有非常重要的意义。2、目前,很少有报道亚洲雨林蝎的毒素多肽。我们从亚洲雨林蝎的毒素腺体分离并鉴定了一组新的抗菌肽,分别命名为：HsAp、HsAp2、HsAp3和HsAp4。这四个多肽含29个氨基酸残基,是带正电荷的两性分子。这类抗菌肽跟其它蝎毒素多肽比对没有同源性,表明这类抗菌肽是一个新家族。抗菌实验发现：HsAp既能够抑制革兰氏阳性菌又能够抑制革兰氏阴性菌的生长,且对这些菌的最低抑菌浓度均在11.8-51.2μM之间；HsAp也能够抑制真菌的生长。基因分析发现,这四个肽的基因均不含内含子。我们的研究扩大了蝎子的抗菌肽家族,同时为蝎子能够适应所处的微生物环境提供了依据。3、从东亚钳蝎和亚洲雨林蝎中分别克隆得到了2个新的富半胱氨酸多肽（MmKTx1和HsVx1）的cDNA全长。这两个肽是一个新的富半胱氨酸肽家族,因其有独特的半胱氨酸结构。HsVx1的基因序列含有两个内含子,它们都在成熟肽编码的区域,且一个属phase1型内含子,另一个属于phase2型内含子。这样的基因类型与已知的基因类型完全不同。通过搜索HsVx1的同源序列,我们得到了59个与HsVx1的半胱氨酸结构一致的同源肽。基因组比较后发现,它们的内含子长度、数量和位点多样性存在着很大的不同。进一步分析HsVx1和类HsVx1多肽发现了30例内含子滑动、11例内含子获得和22例内含子缺失现象。另外还发现,3个类HsVx1多肽XP001658928、XP001658929和XP001658930是由同一个基因（XP基因）编码：前两个多肽由基因的可变剪切产生的：第三个多肽是由在XP基因的第三个内含子的反向互补序列编码的。这些结果强烈的暗示：在不改变半胱氨酸类型的选择压力下,这些富含半胱氨酸的多肽基因的进化来源于内含子滑动、获得、缺失,基因重组,可变剪切：并且这些基因的进化主要由内含子滑动和缺失主导。