应用酵母双杂交技术鉴定绒山羊FAK相互作用蛋白TSC2和AKT

来源 :内蒙古大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:nannoha2
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FAK、AKT、TSC2是参与细胞信号通路的重要蛋白。尽管FAK、AKT、TSC2在人及模式生物中得到了广泛研究,但对山羊FAK、AKT、TSC2的研究较少。对FAK、AKT、TSC2的基因和编码蛋白的研究不仅可以区别物种间的遗传差异和进化特征,而且对动物细胞生长及个体发育过程的研究具有重要意义。本研究首先利用RT-PCR技术克隆绒山羊FAK、TSC2和AKT基因cDNA的全长CDS,分析其组织特异性表达模式。再利用酵母双杂交的方法鉴定FAK与TSC2, FAK与AKT的相互作用关系,再以FAK作为诱饵蛋白利用免疫共沉淀和Western-Blot检测TSC2的存在。结果表明,内蒙古白绒山羊FAK基因cDNA全长3159bp,编码1052个氨基酸;TSC2基因cDNA全长5184bp,编码1727个氨基酸(HQ684023.1);AKT基因cDNA全长1443bp,编码480个氨基酸(HM130679)。根据基因克隆结果,本研究构建了酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-AKT、pGBKT7-FAK1、pGBKT7-FAK2、pGBKT7-FAK3、pGBKT7-TSC2和靶载体pGADT7-AKT、pGADT7-TSC2。酵母双杂交结果显示,FAK可与TSC2、AKT蛋白发生直接相互作用。FAK与AKT的作用发生在FAK的649-1076aa(C-末端侧翼结构域)区域和AKT的1-474aa区域;FAK与TSC2的作用发生在FAK的649-1076aa(C-末端侧翼结构域)区域和TSC2的542-1061aa区域。免疫共沉淀显示FAK与TSC2存在相互作用。本研究结果进一步丰富了绒山羊FAK、TSC2和AKT的基因序列信息,使FAK信号通路和AKT/TSC2信号通路相串联的分子机制得到了进一步阐明。
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