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随着我国养猪业的不断规模化,接种相关疫苗也成为当前防控猪病的首选方案。猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type 2,PCV2)可导致断奶仔猪多系统衰竭综合征、先天性震颤、猪皮炎与肾病综合征、母猪繁殖障碍、猪呼吸道综合征和其他圆环病毒相关疾病,已经给全球养猪事业造成巨大人力、物力损失。接种相关的PCV2疫苗是防控PCV2相关疫病的关键方法。目前,已经市售的猪圆环疫苗分为全病毒灭活疫苗和基于PCV2a亚型的基因工程亚单位疫苗。由于这些疫苗中存在的病毒在灭活过程中导致的抗原决定簇变化也会影响免疫效果,免疫不相关蛋白可能在注射部位产生副作用。此外,PCV2在细胞中生长缓慢,因此全病毒培养获得大批量、高滴度病毒工作量大、成本高,基因工程表达的抗原纯化成本居高不下。因此,迫切需要研制新型、高效、廉价的PCV2疫苗。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是由一种或多种病毒结构蛋白组装而成的不含病毒核酸的空壳结构,不能自主复制,它们与病毒本身有相似的形态结构和抗原性。VLPs作为免疫原不具传染性,它们呈递给免疫细胞的方式与病毒感染相似,并且可以有效地诱导机体内的免疫应答。研究表明,PCV2 Cap蛋白能自我装配成VLPs在抗原性及结构方面和天然的Cap蛋白没有区别,因此,国内外很多科研工作者尝试在不同表达载体上重组PCV2 Cap蛋白。本研究基于Cap蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌的可溶性表达,利用大肠杆菌高密度发酵技术对提高PCV2 Cap VLPs产量的条件进行了优化,为研制新型、高效、廉价的PCV2疫苗奠定基础。本论文研究内容分为以下两个部分:1.PCV2 Cap蛋白的表达鉴定及高密度发酵条件的优化将重组质粒p ET-32a-cap转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主载体上,使用IPTG诱导Cap蛋白表达,通过一系列预处理手段后,对目的蛋白进行SDS-PAGE分析、Western-blot检测和可溶性表达鉴定。结果表明,Cap蛋白在宿主载体上是可溶性表达,透射电镜观察可见Cap蛋白自我装配为形态结构与PCV2病毒颗粒相似的直径为17 nm-20 nm的VLPs。将保存在-70℃重组大肠杆菌p ET-32a-cap甘油菌划线至含氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)的LB固体平板,置37℃恒温培养过夜,次日挑取单菌落于含Amp的5ml新鲜LB液体培养基中,于37℃摇床中振荡培养12h后作为一级菌种备用。按照1:1000在300ml LB液体培养基中接入一级菌种,200 rpm,37℃培养9h,待其OD值达到0.8后停止培养,作为二级菌种。选择合适的培养基高压蒸汽灭菌后按照1:100将准备好的二级菌种加入发酵罐,同时加入Amp,通过优化培养基种类、发酵温度、通气比、消泡剂种类、诱导温度及时间等条件实现重组大肠杆菌p ET-32a-cap的高密度发酵,最后使得重组菌每升菌液的湿菌总量从摇瓶的6.0g/L左右到高密度发酵的30.0g/L,湿菌产量是摇瓶的5倍。2.PCV2 Cap蛋白VLPs规模化制备的条件优化将重组大肠杆菌p ET-32a-cap的高密度发酵菌液4000rpm离心,收集菌体后按照一定比例重悬。通过优化重组菌的裂解方式和Cap蛋白的纯化时饱和硫酸铵的浓度、沉淀温度及沉淀时间来提高PCV2 Cap蛋白VLPs的产量,实现了目的蛋白得率从摇瓶时代的56mg/L到高密度发酵、纯化条件优化后的340mg/L,产率是摇瓶的6倍。换言之,目的蛋白产率提高20%。