结直肠癌(CRC)是全球范围内癌症致死的第三大病因。在中国,结直肠癌是导致恶性肿瘤死亡的第四大原因。目前结直肠癌的主要治疗手段为手术和化学疗法相结合。但是,由于患者对化疗药物的抗药性不仅降低了癌症的治愈率,还给患者带来了严重的不良预后。因此,开发安全、有效的新型抗癌药物已是必然趋势。天然化合物是抗癌新药物的主要来源。杠柳苷元(Periplogenin,PPG)是一种从传统中草药香加皮中提取的天然化合物。目前,关于PPG诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制研究尚无报道。本研究通过MTT法检测PPG对肿瘤细胞活性的影响。以人结肠癌HCT116细胞为例,通过TUNEL法、流式细胞术、蛋白免疫印迹(Western blot)、siRNA干扰等手段揭示了PPG诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制,结果包括以下四个方面:(1)PPG抑制肿瘤细胞增殖,诱导HCT116细胞凋亡。MTT法检测PPG对人结肠癌细胞HCT116、肝癌细胞HepG2、宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MCF7和正常细胞系-大鼠隐窝上皮IEC6细胞活性的影响,结果显示PPG以时间和剂量依赖的方式抑制HCT116、HepG2、Hela和MCF7的增殖,其中结肠癌HCT116细胞对PPG最为敏感,半抑制浓度IC50为10.56±0.28μM。与之相反,PPG对IEC6细胞活性的抑制作用并不明显。流式细胞术和TUNEL实验检测PPG对HCT116细胞凋亡的影响,结果表明,PPG以剂量依赖的方式促进肿瘤细胞凋亡。为进一步验证PPG诱导细胞凋亡,Western blot实验检测PPG对凋亡蛋白表达的影响,结果表明,PPG促进凋亡因子Bax的表达,降低抗凋亡因子Bcl2的表达,并促进凋亡的关键执行蛋白caspase-3和PARP的裂解。(2)活性氧(reactive oxygen species,ROS)信号参与调控PPG诱导的结肠癌细胞凋亡。为了确定ROS是否参与PPG诱导的结肠癌细胞凋亡,采用DCFH-DA荧光检测ROS水平。结果显示,PPG以浓度依赖的方式促进ROS水平升高。预先用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理细胞后,减弱了PPG诱导的ROS生成,细胞凋亡率下降,细胞活性升高。进一步通过Western blot检测NAC对cleaved caspase-3蛋白表达的影响,结果显示,NAC显著抑制了PPG诱导的caspase-3裂解。(3)PPG通过内质网应激(ER stress)途径诱导结肠癌细胞凋亡。Westernblot检测PPG对ER stress相关蛋白表达的影响。结果显示,PPG上调Bip、p-eIF2ɑ(Ser51)、CHOP蛋白水平,同时促进IRE1ɑ、p-JNK(T183/Y185)蛋白表达,抑制p-ASK1(Ser966)蛋白表达。siRNA干扰CHOP/JNK后,凋亡蛋白cleaved PARP蛋白水平下降;同时,JNK的特异性抑制剂SP600125同样抑制了PPG诱导的PARP裂解。上述结果表明,PPG通过激活ER stress途径中Bip-eIF2ɑ-CHOP和IRE1ɑ-ASK1-JNK两条信号通路诱导结肠癌细胞凋亡。(4)ROS作为ER stress途径的上游信号参与调控PPG诱导的结肠癌细胞凋亡。Western blot检测NAC对ER stress相关蛋白表达的影响。结果显示,NAC抑制了PPG对Bip、p-eIF2ɑ(Ser51)、CHOP,IRE1ɑ和p-JNK(T183/Y185)蛋白表达的上调作用,促进了PPG引起的p-ASK1(Ser966)蛋白表达升高。因此,PPG通过激活ROS介导的ER stress途径诱导结肠癌细胞凋亡。综上所述,本研究发现PPG可抑制多种肿瘤细胞活性,且对正常细胞毒性微弱;此外,PPG通过激活ROS/ER stress通路包括Bip-eIF2α-CHOP和IRE1α-ASK1-JNK两条信号传导途径诱导结肠癌细胞凋亡,提示PPG具有潜在的抗结肠癌药物开发价值。