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研究背景及目的本实验旨在探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)对口腔舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)细胞的抑癌作用,包括对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭生物学表型的影响;探讨EGCG对TSCC细胞的抑制作用是否由TAZ进行介导及其上游可能的调控机制。通过探究TSCC细胞中EGCG与TAZ因子之间的联系,从而丰富EGCG抗口腔癌的分子机制,并尝试找到合适的作用靶点,为EGCG作为TSCC的新型化疗药物提供分子理论基础,也为TSCC的药物治疗提供更多的选择及可能。方法1.检测EGCG对舌鳞状细胞癌CAL27与SCC15细胞增殖的影响。采用CCK-8实验检测不同浓度药物作用24 h后,CAL27细胞与SCC15细胞增殖的变化;不同浓度药物连续作用4-5天,观察CAL27细胞与SCC15细胞生长曲线的变化。并检测增殖相关蛋白Erk、p-Erk、Akt、p-Akt的改变。2.检测EGCG对舌鳞状细胞癌CAL27与SCC15细胞凋亡的影响。采用流式细胞术检测不同浓度药物作用24 h后,CAL27细胞与SCC15细胞凋亡的变化,并对实验结果进行统计学分析。观察凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、PARP、Cleaved PARP的改变。3.检测EGCG对舌鳞状细胞癌CAL27与SCC15细胞迁移和侵袭的影响。采用划痕实验和transwell实验检测不同浓度药物作用一定时间后,CAL27细胞与SCC15细胞迁移和侵袭的变化,对实验结果进行统计学分析。并观察表型相关蛋白 Vimentin、E-Cadherin的变化。4.检测舌鳞状细胞癌中EGCG与TAZ及其上游信号因子的关系。不同浓度EGCG作用于CAL27细胞与SCC15细胞24 h,采用Western blotting实验检测Hippo相关因子TAZ、p-TAZ、MOB1、LATS1、MST1、SAV1 的变化及JNK、p-JNK的变化,并对结果进行统计学分析。分别提取细胞质和细胞核的蛋白,检测TAZ蛋白水平的变化,并对结果进行统计学分析。5.检测过表达TAZ能否在一定程度上逆转EGCG对CAL27细胞的抑制作用。采用过表达TAZ的慢病毒载体(Overexpression TAZ,OE TAZ)和空载体(Negative Control,NC)分别转染CAL27细胞,Western blotting和qRT-PCR检测转染效率。并将细胞分为四组:OE TAZ组;OE TAZ+EGCG组;NC组;NC+EGCG组。利用CCK-8和EdU实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移,transwell实验检测细胞侵袭。并对结果进行统计学分析。6.EGCG与辛伐他汀联合应用对CAL27细胞生物学表型的影响。以往研究证实辛伐他汀可以通过Hippo-TAZ抑制CAL27细胞的生物学性状,现将EGCG与辛伐他汀叠加作用,观察对CAL27细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响,并对结果进行统计学分析。结果1.EGCG抑制舌鳞状细胞癌CAL27与SCC15细胞的增殖。结果显示,随着药物作用时间的延长,药物浓度的增加,细胞增殖明显减慢。实验结果具有统计学意义。增殖相关蛋白的改变与表型变化基本一致。2.EGCG促进舌鳞状细胞癌CAL27与SCC15细胞的凋亡。结果显示,两种细胞对EGCG呈浓度依赖性。实验结果具有统计学意义。凋亡相关蛋白的改变与表型变化基本一致。3.EGCG抑制舌鳞状细胞癌CAL27与SCC15细胞的迁移和侵袭。结果显示,药物作用时间越长,药物浓度越高,细胞迁移的距离越少;药物浓度越高,细胞侵袭至下室的数目越少。且实验结果具有统计学意义。相关蛋白的改变与表型变化基本一致。4.EGCG下调了TAZ及其上游信号因子的蛋白表达。Western blotting实验结果显示,随EGCG浓度的增高,TAZ、p-TAZ的蛋白水平降低,且其上游相关因子MOB1、LATS1蛋白水平降低,MST1、SAV1的变化无明显趋势。JNK蛋白水平基本不变,p-JNK表达水平降低。细胞质和细胞核中TAZ的蛋白水平均降低。结果具有统计学意义。5.QRT-PCR和Western blotting结果显示,成功构建了过表达TAZ病毒的CAL27细胞株。过表达TAZ可以减弱EGCG对CAL27细胞生物学行为的影响,包括增殖、凋亡、迁移和侵袭。6.EGCG和辛伐他汀的联合应用与EGCG单独作用相比,对CAL27细胞的增殖、迁移、侵袭的抑制作用更加明显,对其凋亡的促进作用更加明显。结论EGCG可以通过TAZ影响TSCC细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,其上游可能通过p-JNK进行介导。