他达那非作为第二代磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂,是一种治疗男性勃起功能障碍的处方药,经常被非法添加到声称具有抗疲劳、增强免疫力、补肾壮阳等功能的保健食品中。但此类药物与硝酸酯类药物同时服用会引起低血压,甚至死亡。因此,加强对此类药物非法添加的监控对保障食品安全至关重要。目前,此类药物的检测主要依赖于液相色谱、气相色谱及色谱质谱联用等大型仪器手段。但是,大型仪器分析方法检测成本高、需要专业的操作人员、且不能进行现场监控,难以普及,尤其是在经济支持薄弱的基层单位。免疫分析法是运用抗原抗体反应与酶促反应相结合的一种快速、灵敏、低成本、易于现场操作的检测技术,可与大型仪器确证技术形成互补,高低搭配,满足大批量样品的快速、筛查确证检测需求。目前,有关PDE-5抑制剂他达那非类药物的免疫检测方法尚未见报道。因此,本文以他达那非为对象,开展半抗原/抗原设计合成、动物免疫及宽谱特异性抗体制备、间接竞争酶联免疫分析方法和胶体金免疫层析试纸条等研究。主要研究内容和结果如下:(1)以氨基他达那非为原料设计合成出了5种半抗原H1~H5,并通过偶联载体蛋白进行动物免疫及抗血清的筛选,制备得到了2种高效的能够特异性识别他达那非类药物的抗体PAb-H5-AmTD-MA和PAb-H5-AmTD-MA-KLH,在1μg/mL他达那非药物条件下,其抑制率分别为89%和95%。(2)基于PAb-H5-AmTD-MA抗体建立了检测他达那非类药物的间接竞争酶联免疫分析(ic-ELISA)方法。通过优化确定了最佳反应参数:包被原浓度为32.15 ng/m L,抗体稀释倍数为8 k,药物稀释缓冲液为pH 8.4的0.01 mol/L含0.2%吐温-20的PBST,竞争反应时间为40 min,二抗反应时间为30 min,显色时间为10 min,体系中甲醇浓度控制在5%以内,建立了ic-ELISA方法,该方法对他达那非的检测限(LOD)为0.027ng/mL、IC50为0.90 ng/m L、线性范围(IC20-IC80)为0.099~8.22 ng/mL;保健酒、胶囊等固体和液体保健食品样品中他达那非的平均添加回收率在84.92%~116.19%之间,变异系数在6.37%~14.28%之间,与HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好(R2=0.9993)。(3)基于PAb-H5-AmTD-MA-KLH抗体制备了检测他达那非类药物的胶体金免疫层析试纸条(GICA)。通过柠檬酸还原法烧制了~16nm的胶体金溶液,并优化确定了最佳方法条件为:胶体金标记抗体时胶体金溶液pH值为8.5、抗体用量为0.75μg/m L;金标抗体及包被原浓度均不稀释最佳,此时金标抗体浓度为原始胶体金溶液的1/10,包被原浓度为1 mg/mL;最佳的样品垫膜材质为GF-06;样品垫处理液为0.2M pH 7.5 Tris-HCl缓冲液;药物稀释液为0.01 M pH 7.4的PBST,其甲醇含量最好不超过5%;质控线二抗稀释倍数为30倍,此时二抗浓度为0.27 mg/mL,进一步构建了定量分析GICA试纸条,对他达那非的检测范围为0.71~141.99 ng/mL,IC50为10.04ng/mL;保健酒、胶囊等固体和液体保健食品样品中他达那非的平均回收率在93.34%~121.50%,平均变异系数在0.95%~13.33%,与HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好(R2=0.9598)。(4)采用以上两种方法对保健酒类液体样品及固体样品盲样进行检测,发现9种保健酒中有3种检测为阳性,13种固体样品中有4种检测出为阳性,且含量均在μg/m L以上;与HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好,相关系数平方(R2)分别为0.9758(ic-ELISA)、0.9287(GICA)。