论文部分内容阅读
半滑舌鳎是一种在我国广泛养殖的经济鱼类，本文以山东海阳工厂化养殖的半滑舌鳎为研究对象，利用多种分子生物学技术手段系统研究了半滑舌鳎Gadd45g基因的全长cDNA克隆，分析其基因序列的进化性，较为系统的研究了基因在半滑舌鳎组织和性腺发育中的表达，成功将基因定位于半滑舌鳎染色体上。这些基础性的研究资料将填补半滑舌鳎Gadd45g基因研究的空白，为揭示半滑舌鳎的性别决定机制奠定了基础，对半滑舌鳎性别控制有积极地作用。1半滑舌鳎Gadd45g基因的克隆和功能分析本研究根据半滑舌鳎全基因组测序结果，利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术和cDNA末端快速扩增（RACE）技术，成功的在半滑舌鳎中克隆得到了3种Gadd45g基因的全长cDNA序列。Gadd45g1和Gadd45g2基因全长分别是1270bp和1181bp，都有480bp的开放阅读框，分别编码159个氨基酸残基的蛋白，而Gadd45g3基因全长1147bp，编码155个氨基酸。利用生物分析软件和网站对基因编码的氨基酸进行比对分析，发现尽管他们均有保守结构域，但Gadd45g1基因和Gadd45g2基因相似度高，与硬骨鱼中的Gadd45g型基因及高等哺乳动物的Gadd45g基因有较近亲缘关系，而Gadd45g3基因则与硬骨鱼中的Gadd45g-like型基因有较相似。利用荧光实时定量PCR技术对半滑舌鳎各组织中的3种Gadd45g基因的表达进行了分析，发现Gadd45g1基因只在雌鱼中表达，且在肝脏表达最高，其次为性腺；Gadd45g2基因在雌鱼性腺表达最高，在雌鱼其他组织及雄鱼的所有组织均微量表达；Gadd45g3基因在雌雄鱼的脑中表达最高。对比雌、雄和伪雄鱼的性腺中3种基因的表达，发现Gadd45g1和Gadd45g2基因在半滑舌鳎雌鱼性腺中表达高，在雄鱼和伪雄鱼中表达低；Gadd45g3基因在雄鱼和伪雄鱼的性腺中高表达，在雌鱼性腺中表达低。在半滑舌鳎仔鱼的性腺发育各时期，对3个基因的表达研究发现，Gadd45g1基因在50d即半滑舌鳎性腺即将分化的时期表达相对较高，该基因可能是半滑舌鳎性别决定的关键基因；Gadd45g1和Gadd45g2在95d后的雌鱼性腺中均有较高表达，暗示他们在卵巢发育中有重要作用；Gadd45g3在20d雄鱼性腺中表达高，随后降低，它对半滑舌鳎雄性性别的影响可能早于性腺分化时期，且在精巢和卵巢发育早期有较高表达。2半滑舌鳎Gadd45g基因的染色体荧光原位杂交对上述克隆得到的3种Gadd45g基因进行BAC文库筛选，成功找到含有目的基因的单一BAC克隆。3个Gadd45g基因分别定位在克隆Bam002C14，Hind029A24和Bam027D12上。利用BAC-FISH技术，制备探针并与染色体玻片杂交，成功将基因定位在半滑舌鳎染色体上，信号可见。其中Gadd45g1基因在W性染色体上；Gadd45g2基因在Z性染色体上；Gadd45g3基因位于常染色体上。