RNAi沉默STAT3基因诱导BEL-7402肝癌细胞凋亡的实验研究

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原发性肝细胞癌(Hepatocelluar Carcinoma, HCC)是严重损害全球人类生命健康的消化系统恶性肿瘤,发病率居所有恶性肿瘤中第6位,死亡率居第3位,每年死亡人数基本等于新发病数,并呈现逐年增加的趋势,专家们预计2015年——20年达到疾病平台期。肝细胞癌的发生是多步骤,多基因作用的结果。肝细胞癌的主要危险因素包括感染HBV或HCV、酒精性肝病和非酒精性血液系统疾病,并与地理区域以及种族或民族有关。HCC早期无明显症状,转移早,发现晚,恶性程度高,能够手术切除的患者较少,预后差,即使手术治疗,大多数患者术后2年复发率和5年复发率分别为50%和75%。目前,肝细胞癌的诊断和治疗手段得到了不断提升,首选方滤还是以手术为主的综合治疗,但肝细胞癌患者的预后仍不理想。因此,深入研究及了解肝细胞癌的发生发展作用机制,才能早期诊断,早期治疗,提高患者的生存期和生活质量。研究表明原发性肝细胞癌发生、发展与多种信转导通路的异常激活或者异常沉默有着密切联系。JAK/STAT3言号转导途径介导肿瘤细胞与基质或免疫细胞之间的联络,调控和诱导与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡密切相关的基因异常表达,促进肿瘤细胞增殖、恶性转化、阻碍凋亡。JAK和STAT3是许多细胞因子受体系统的关键分子,STAT3通过多肽类配体与它们的受体相结合而被激活,同时也可以被细胞内的激酶激活,进而介导细胞激酶,生长因子和激素等信号转导至细胞核,参加细胞生长、新陈代谢、分化、生存、抑制细胞凋亡和抵抗外源性病原体。细胞因子等配体与受体结合后,gp130 (CDw13,免疫球蛋白超家族IGSF成员)趋附于受体分子LIFR,并相结合形成二聚体,JAK分别与LIFR和gp130相结合,激活相应的JAK,活化的JAK自身磷酸化,并进一步磷酸化LIFR和gp130, gp130和LIFR磷酸化位点作为STAT3的SH2区锚链位点,当然STAT3的SH2区锚链位点也可以与其他受体结合,激活其他信号转导途径,如MAPK、PI3K/Akt信号转导途径。活化的STAT3与受体分离,两个STAT3分子间通过SH2区相连接形成形成二聚体,随后穿行核孔,进入细胞核,STAT3分子与DNA相应区域结合,诱导血管生成相关基因,细胞周期调控基因及抗凋亡基因等基因表达。研究表明,如果STAT3发生异常激活就会导致细胞的异常增殖、恶性转化、调亡抑制以及免疫抑制。多中心研究显示,肝细胞癌等恶性肿瘤细胞中JAK/STAT3信号转导途径持续性激活及STAT3过表达,磷酸化STAT3在肝细胞癌等恶性肿瘤中高表达。活化的STAT3促进肝细胞癌的发生,提高肝癌细胞再生能力和侵袭性。肿瘤的生长依赖血管的生成,通过新生血管给肿瘤细胞提供丰富的养料与氧分,JAK/STAT3信号转导途径调节VEGFR-2的表达,是肿瘤血管新生和肿瘤细胞转移的主要因子。STAT3是影响肿瘤细胞免疫反应的一个重要分子,控制肿瘤细胞分泌细胞因子来调节免疫反应,造成肿瘤细胞免疫逃逸。RNAi (RNA interference)——RNA干扰,是指一系列非编码RNA,由21-23 bp长的双链RNA分子介导,诱发同源mRNA降解的转录后基因沉默(PTGS)机制。研究人员设计目标内源性mRNA,合成siRNA,核糖核酸内切酶制备siRNA或siRNA的前体(如短发夹RNA (shRNA)或长的双链RNA (dsRNA),将其倒入细胞内甚至整个器官内,高通量将基因沉默,对经典基因研究和治疗方式产生了挑战。RNAi是一种转录后基因沉默(PTGS)小分子调控RNA,包括小NA (miRNA, microRNA)和小干扰RNA (siRNA, small interfering RNA),是保护不受外部基因甚至内部基因侵扰,控制细胞生长,调控基因表达,生物体适应外界环境的重要机制,是一种比较早期的动植物,甚至微生物等生命体就已经具有的生物途径。作为转录后基因沉默(PTGS)机制的特殊性,RNAi已经成为肿瘤学基础及临床研究的一种工具。转录因子将细胞外信号转导入基因组中,是肿瘤发生、发展的关键因素,阻断转录因子是目前恶性肿瘤治疗的有效方法,针对肿瘤的靶向治疗的研究,在不同水平中断肿瘤细胞中STAT3信号通路,阻断转录因子STAT3的表达,诱导肿瘤细胞的凋亡。RNA干涉技术靶向阻断STAT3基因具有高效、特异、操作简便、低毒等特点。为研究JAK/STAT3信号转导途径对肝癌细胞凋亡的影响,本实验拟通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)沉默BEL-7402肝癌细胞STAT3基因。该研究可能为靶向肿瘤基因治疗提供实验依据。首先构建靶向STAT3的RNA干扰载体,应用脂质体LipofectamineTM 2000将前期构建的pGC-STAT3-siRNA质粒转染至BEL-7402肝癌细胞,并检测其基因沉默效应,根据实验分为对照组、阴性质粒组、STAT3-siRNA组,分别通过分别通过流式细胞术,检测细胞凋亡比率的变化,JC-1荧光染色观察线粒体膜电势△甲m变化,并利用Western Blot方法检测Caspase 3蛋白质水平的变化。JAK/STAT3信号转导途径与肝细胞癌有关联,通过流式细胞术检测结果显示,对照组,阴性质粒组及STAT3-siRNA)贡粒组凋亡率分别为9.26±0.42%,17.53±0.98%及45.24±0.79%,经统计学分析,STAT3-siRNA组细胞凋亡率明显高于对照组和阴性质粒组(P<0.05),靶向STAT3促进BEL-7402细胞凋亡。凋亡(apoptosis)是细胞在多种因素作用下,通过基因调控而发生的一系列程序化细胞死亡想象,普遍存在于生物界。细胞凋亡早期核酸酶的激活及磷酯酰丝氨酸的膜暴露晚于线粒体膜电位△Ψm下降,本实验检测各组细胞△Ψm的数值变化结果显示:实验组细胞红色荧光减弱,绿色荧光增强,线粒体膜电位△Ψm降低(58.87±1.90%,P<0.05),对照组及阴性质粒组细胞绿色荧光相对较弱,红色荧光较强,线粒体膜电位△Ψm较高(90.73±1.75%,90.03±1.68%,P<0.05),说明靶向STAT显著降低BEL-7402肝癌细胞线△Ψm,引起线粒体膜去极化作用。1994年caspase-3基因被Fernandez-Alnemri从数据库筛选、克隆,1996年将其编码的这种蛋白酶命名为caspase-3,目前已经获得caspase-3的X线结晶图像。caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,在细胞凋亡中起着不可替代的作用。凋亡途径最终启动,caspase-3被降解为分子量为P17/19的acti ved-caspase-3至关重要,细胞核中的多聚ADP-核糖聚合酶(PARP,116kD)被活性caspase-3剪切,使其不能与DNA有效结合,导致Ca2+/Mg2+依赖性内切核酸酶的活性增高,进而裂解核小体间的DNA,引起细胞凋亡。Western Blotting结果显示actived-caspase3蛋白(17/19 kDa)在实验组表达明显高于对照组和阴性质粒组(0.48±0.05 vs.0.22±0.04和0.26±0.06,P<0.05),Caspase 3(35kDa)表达各组无明显差异(P>0.01)(图4)。提示siRNA-STAT3冗默STAT3基因可明显降低细胞线粒体△Ψm,激活caspase-3增强,促进肝癌细胞凋亡、坏死。Bcl-2家族是调节线粒体通透性的主要成分,与细胞死亡信号相连接,对细胞的死亡起决定作用。本实验通过siRNA-STAT3沉默STAT3基因,阻断JAK/STAT3信号转导途径,阻断Bcl-2基因转录,Bcl-2表达水平下降,Bcl-2同源二聚体形成受到抑制,Bax就不能与Bcl-2相结合,那么Bax就会大量在线粒体膜上形成二聚体,导致线粒体膜电势能下降,激活caspase家族一系列蛋白分子,引起凋亡级联反应,促进Bel-7402肝癌细胞凋亡。总之,通过RNAi沉默BEL-7402肝癌细胞STAT3基因,从翻译水平阻抑STAT3基因表达,来抑制JAK/STAT3信号转导途径,增加了肝癌细胞的凋亡率,表现出更强大而且稳定的促凋亡作用,为肝癌细胞的信号转导途径靶向治疗的优化提供了体外实验数据。
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