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低聚果糖(Fructo-oligosaccharide,FOS),是一种广泛存在于水果和蔬菜中的功能性低聚糖。该糖具有良好的口感和优良的生理功能,已应用于食品、饲料、卫生防疫、保健等许多领域。目前商业性低聚果糖大多通过产果糖基转移酶的微生物生产获得。
本研究采用Plackett-Burman(P-B)试验设计,对影响产果糖基转移酶(sucrose:sucrose1-fructosyltransferase,1-SST)的米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株GX-0010发酵的重要因子进行了筛选。对蔗糖、蛋白胨、硫酸亚铁、pH值、温度、培养时间、装液量和接种量等8个因素进行了试验,统计分析结果表明,pH、温度和装液量对米曲霉菌株GX-0010产果糖基转移酶具有显著的影响。
通过紫外线、紫外线+氯化锂、微波和微波+氯化锂4种方法对米曲霉菌株GX-0010进行了诱变,得到了10个酶活高于原始菌株的突变株,其中UVLi3突变株的产酶活力最高,比对照高45.4％。
采用P-B设计和响应面分析法(ResponseSurfaseAnalysis,RSA)对影响突变株UVLi3产果糖基转移酶的10个培养基组分进行重要影响因子筛选。P-B实验设计与统计学分析表明,酵母膏、Na2SO4和MgSO4·7H2O是影响UVLi3酶活的重要因子。以酶活为响应目标,对该3个因子进行响应面设计,并经响应面法优化分析得到了影响酶活的二阶模型,确定了突变株UVLi3的最优培养基条件为:酵母膏0.30g/L,Na2SO40.033g/L、MgSO4·7H2O0.027g/L,此条件下预测酶活为37.99U/mg,验证得到实际酶活为35.856U/mg,结果与模型预测值基本一致,优化后UVLi3的酶活提高了42％。
以米曲霉GX-0010总DNA为模板,根据已报道的臭曲霉(Aspergillusfoetidus)果糖基转移酶基因保守序列设计引物,用PCR方法扩增到了GX-0010菌株的1-SST基因,该基因编码区由2个外显子和1个内含子构成,编码1个含537个氨基酸的蛋白。进行序列比较表明,虽然米曲霉的1-SST基因核苷酸序列与臭曲霉1-SST基因有一定差异,但是该基因编码的这一蛋白与臭曲霉1-SST同源性达100％。对该蛋白进行活性位点和结构域分析表明,该酶属于糖苷水解酶32家族。生物信息学分析表明,米曲霉所产的1-SST信号肽位于第1-20个氨基酸残基之间,其二级结构和三级结构与Aspergillusawamor的外切菊粉酶十分相似,都具有糖苷水解酶32家族的活性位点,且包含有N端五个叶片状螺旋结构和C端类三明治的模块的结构。
将所获得的1-SST编码序列克隆到pCPXBn载体,再加入绿色荧光蛋白GFP基因形成融合蛋白,构建了过量表达1-SST的重组质粒pCPXBn-SST-GFP。用此质粒转化米曲霉GX-0010原生质体,获得表达GFP绿色荧光的转化株。将经过PCR分子鉴定的3个转化株进行摇瓶发酵试验,结果表明转化株的1-SST活力比出发菌株提高了10％以上,证明了用遗传工程方法将额外的果糖基转移酶基因导入米曲霉菌株,可以提高果糖基转移酶酶活的可行性。