2型糖尿病是复杂的基因遗传背景与现代生活方式(能量摄入过多及体力活动减少)共同作用而导致胰岛素作用障碍(胰岛素抵抗)和胰岛素分泌相对缺陷。胰岛素抵抗与非酒精性脂肪肝(NAFLD)关系密切，在2型糖尿病患者中NAFLD发病率高达50-75％。2型糖尿病是NAFLD患者发生肝纤维化的独立危险因素，其纤维化进展更加迅速，并显著增加死亡率。一项日本的研究，在空腹血糖正常人群的NAFLD患病率达27％，空腹血糖受损的患者达43％，而在新诊断的2型糖尿病患者高达62％。因此，在初诊的糖尿病中，积极治疗非酒精性脂肪肝显得尤其重要。 胰岛素是已知最重要的代谢调节激素，能快速有效地调节搪、脂代谢。此外，胰岛素还有促生长、增殖、分化的功能和促进脂肪合成的作用。英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)表明使用胰岛素进行严格的血糖控制显着增加循环中胰岛素浓度，加剧了2型糖尿病患者的高胰岛素血症。Anderwald等给2型糖尿病患者分别输注胰岛素12小时或67小时，发现肝脏及肌肉脂肪合成是增加的，而全身的胰岛素敏感性并未改变。国内也有学者的研究发现外源性胰岛素能促进SD糖尿病大鼠肝脏的脂肪沉积。因此，用胰岛素治疗2型糖尿病，在降低血糖、调节血脂的同时，是否加重高胰岛素血症？在高胰岛素血症的背景下是否加重肝脏的脂肪沉积？这一顾虑成为早期使用胰岛素治疗2型糖尿病的障碍。目前的治疗模式是，直到多种口服降糖药联合作用失效才使用外源性胰岛素。 但是，近年的临床研究使人们对早期胰岛素治疗的价值有新的认识。我们及国外的学者的研究发现：对早期诊断的2型糖尿病患者使用胰岛素治疗，除了快速解除高血糖等代谢紊乱、相当程度上改善胰岛β细胞功能，还减轻了整体的胰岛素抵抗。这种治疗收益可能对改善2型糖尿病的预后、延缓疾病的进展、治疗与胰岛素抵抗密切相关的疾病带来好处。这一新的临床发现对早期胰岛素治疗的利与弊提出了新的挑战。最近的临床研究提示6个月的基础胰岛素治疗达到良好血糖控制的同时，改善了肝脏胰岛素的敏感性和减轻了肝脏的脂肪沉积。这一结果提示早期的胰岛素干预可能对2型糖尿病患者的非酒精性脂肪肝的治疗有利。但其具体机制不清楚？ 由于肝脏在机体的糖、脂代谢调节中起重要作用，肝脏胰岛素抵抗在2型糖尿病和非酒精性脂肪肝的发生机制中起重要作用，肝脏的胰岛素抵抗也是2型糖尿病和非酒精性脂肪肝治疗的重要靶点。我们拟借助理想的2型糖尿病伴脂肪肝的动物模型，深入研究早期胰岛素治疗对肝脏的胰岛素信号通路和脂肪的沉积的影响以及其可能机制。 第一章2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝模型的建立.高脂饮食诱导C57BL/6小鼠的代谢异常和肝脏表现 一、研究目的: 建立类似人类2型糖尿病伴有非酒精性脂肪肝病理生理特点的动物模型。 二、研究方法: 1.实验动物及分组 雄性C57BL/6小鼠30只，5周龄，分为A、B、C组，每组10只。A组给予普通标准小鼠饲料，B组、C组给予高脂饲料喂养。 2.饲料配制: 普通标准小鼠饲料脂肪含为4.43g/100g，供热百分比脂肪9.9％，碳水化合物63.93％，蛋白质26.18％。高脂饲料脂肪含量占38.2g/100g，供热百分比脂肪60％(脂肪主要来自猪油)，碳水化合物28.21％，蛋白质11.9％。 3.评估指标: (1)体重 (2)非空腹血糖(3)经腹葡萄糖耐量试验(IPGTT) (4)血脂：游离脂肪酸(FFA)甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC) (5)肝脏的脂肪含量和病理 三、结果: (1)高脂饮食组小鼠体重显著高于对照组，呈现明显腹型肥胖。 (2)高脂饮食组小鼠非空腹血糖及经腹葡萄糖耐量试验的各观察点血糖均显著高于对照组。且高脂饮食组小鼠血糖高峰延迟至注射葡萄糖后30分钟。 (3)高脂饮食组小鼠的FFA及TC均高于对照组.两组间的TC水平有统计学差异，FFA有升高趋势。TG水平在两组间无统计学差异。 (4)高脂饮食组小鼠肝脏的TG含量显著高于对照组，肝脏HE染色显示全小叶肝细胞排列紊乱，大多数肝细胞胞质充满脂滴，呈显为大小不等空泡样变性，中度脂肪变性。 四、结论: 我们成功地以高脂肪含量的饮食诱导C57BL/6小鼠发生肥胖、糖调节受损、显著的肝脏脂肪沉积。该模型类似人类2型糖尿病伴有非酒精性脂肪肝的特点。可作为2型糖尿病和非酒精性脂肪肝发病机理研究和治疗机制研究的天然理想模型。 第二章胰岛素干预对C57BL/6糖尿病伴非酒精性脂肪肝小鼠肝脏胰岛素信号通路和脂肪沉积的影响 一、研究目的: 通过westernblotting等分子生物医学技术研究胰岛素干预对肝脏脂肪沉积、糖脂代谢功能及胰岛素信号通路的调节作用。 二、研究方法: 1.胰岛素干预：高脂喂养12周的C57BL/6小鼠给予甘精胰岛素干预4周。 2.测定血脂和肝脏的脂肪含量。 3.提取肝脏组织总RNA，用于RT—PCR；测定肝脏胰岛素糖脂代谢信号通路基因的差异表达。 4.提取肝脏组织的胞浆蛋白和核蛋白，用于westernblotting；测定肝脏胰岛素糖脂代谢信号通路蛋白的差异表达。 三、结果: 1.胰岛素干预组的空腹血糖和IPGIT所有观察点的血糖均较高脂饮食组显著改善。 2.血脂水平：胰岛素干预组的血浆TC、FFA比高脂饮食组显著降低，干预组的TG比高脂饮食组有下降趋势。 3.肝脏脂肪含量：胰岛素干预组小鼠肝脏的TG比高脂饮食组显著降低，TG显著降低达20.71％，TC变化不明显。 4.肝脏HE染色：胰岛素干预组小鼠肝脏空泡样变性明显减少，细胞内仅可见少许小泡性脂肪滴。 5.基因、蛋白的变化：高脂饮食组肝脏调控糖异生的G6Pas、PEPCK蛋白和调控脂代谢的SREBP-1、SREBP—2蛋白、SREBP-1c、FASmRNA的表达显著升高；炎症分子TNF—a蛋白显著升高；IRS—2蛋白的表达显著下调。胰岛素治疗下调了肝脏TNF—a、SREBP-1蛋白和SREBP-1c、FASmRNA的表达；抑制调控糖异生的G6Pas、PEPCK的表达；上调肝脏IRS—2的表达，SREBP—2无明显变化。 四.结论: 在高脂饮食诱导2型糖尿伴有非酒精性脂肪肝的C57BL/6小鼠模型中，胰岛素治疗改善了急性糖负荷(IPGTT)后的糖调节能力；改善了血脂谱；减少了肝脏的TG含量。下调了肝脏TNF—a、SREBP-1c的表达；抑制调控糖异生的G6Pas、PEPCK的表达；上调肝脏IRS—2的表达。从而改善了肝脏的胰岛素信号通路、减轻了胰岛素抵抗、减少了肝脏的脂肪沉积、纠正了糖脂代谢紊乱。