背景:丝状真菌是具有广泛生物活性药物主要来源之一,如抗生素青霉素(penicillin)、降胆固醇药洛伐他丁(lovastatin)和抗真菌药灰黄霉素(griseofulvin)等。真菌天然产物具有复杂的结构多样性,根据其生物来源和骨架类型主要分为聚酮类(polyketides)、萜类(terpenoids)、聚酮-萜杂合类(polyketide-terpenoids)、多肽类(peptides)、生物碱类(alkaloids)和莽草酸衍生物类(shikimate)。其中,聚酮-萜杂合类天然产物由聚酮和异戊烯基单元构成,其代表性化合物为免疫抑制剂霉酚酸(mycophenolic acid,MPA),抗血管生成药物烟曲霉素(fumagillin)以及抗增殖药aspernidine A。MPA对鸟嘌呤核苷酸生物合成途径中的限速酶次黄嘌呤核苷脱氢酶(inosine monophosphate dehydrogenase,IMPDH)有高效的抑制活性,从而阻断脱氧核糖核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的合成。因此,鉴于MPA独特的作用机理,其具有诸如抗病毒、抗真菌、抗细菌、抗肿瘤、抗牛皮癣和免疫抑制活性等重要的生物活性。但是,MPA在免疫治疗时所引起的各种副反应,如腹泻、白细胞减少症、败血症、呕吐等,在一定程度上限制了MPA应用。目前,基于MPA异戊烯基侧链的修饰及改造,从而获得活性更高副反应更低的MPA衍生物是其化学结构改造的重点。目前,MPA生物合成基因簇(mpa gene cluster)相继在Penicillium brevicompactum IBT23078、P.brevicompactum NRRL 864、P.roqueforti FM164和P.roqueforti CECT中被克隆和鉴定。基因簇mpa含有7个开放阅读框(open reading frames,ORFs)MpaA-H,包括异戊烯基转移酶(MpaA)、非还原聚酮合酶(MpaC)、P450氧化酶-水解酶融合蛋白(MpaDE)、次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(MpaF)、O-甲基转移酶(MpaG)、α/β-水解酶(MpaH)和未知功能蛋白(MpaB)。1)通过在不产MPA的Aspergillus nidulans菌中异源表达MpaF,显著增加A.nidulans的MPA抗性,证明了MpaF为MPA产生菌的自身抗性基因;2)经过体内遗传及体外酶学生化研究表明,MpaC催化1分子乙酰辅酶A、3分子丙二酰辅酶A和1分子S-腺苷甲硫氨酸(S-asenosylmethionine,SAM)合成5-甲基苷色酸(5-methylorsellinic acid,5-MOA)。融合蛋白酶(MpaDE)催化2步连续反应,将5-MOA转化为5,7-二羟基-4-甲基苯酞(5,7-dihydroxy-4-methylphthalide,DHMP)。MpaG催化脱甲基霉酚酸(demethylmycophenolic,DMMPA)中聚酮骨架结构DHMP的C-3位羟甲基化形成MPA;3)除此而外,剩下的MpaA、MpaH及其未知功能蛋白MpaB可能参与MPA异戊烯基侧链的上载和断裂过程,但从未见相关功能研究的报道。因此,本课题以MpaA/B/H为核心研究对象,试图通过体内基因敲除实验、相关中间体分离鉴定及化学回补、体外酶学表征等综合研究策略和方法,阐明MPA异戊烯基侧链生物合成的独特机制,从而完全揭示完整的MPA生物合成途径,为后续基于生物酶工程和代谢工程手段的MPA合成生物学的改造奠定坚实的理论基础。目的:1.在灰黄青霉菌(P.griseofulvum)中鉴定合成MPA的生物合成基因簇。2.通过构建MpaA/B/C/H基因敲除突变株,检测其对应的积累产物。3.通过对MpaA/B/H的体外生化研究,阐明其在MPA异戊烯基侧链生物合成过程中的作用,并探讨其酶学反应机理。4.根据上述体外生化研究结果,进一步探索MpaA/B对于MPA异戊烯基侧链生物学改造的意义。方法:1.对P.griseofulvum全基因组测序,通过本地Blast搜索MPA的生物合成基因簇mpa,应用2ndFind、Pfam和NCBI等软件对该基因簇mpa进行解析,得到簇中所有功能基因的编码序列。2.应用Snapgene软件设计引物,DNAMAN软件进行蛋白同源对比分析,Phery2在线进行蛋白同源建模,Clustalx 2.1和MEGA 6.0进行系统进化树构建,应用TMHMM Server v.2.0进行蛋白跨膜区预测。3.通过构建分裂标签敲出载体,利用原生质体转化方法获得MpaA/B/C/H基因突变株,高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC)分析对应中间产物保留时间和紫外吸收,液相色谱-质谱联用(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)鉴定对应化合物分子量,通过半制备液相分离化合物,利用核磁共振鉴定化合物结构。4.通过酶切连接或酵母同源重组等分子手段构建MpaA/B/H/G蛋白的酵母表达载体。通过化合物喂养实验初步验证其功能,阐明MPA异戊烯基侧链可能的生物合成途径。5.通过亲和层析(MpaB)或提取微粒体(MpaA)等方法获得对应蛋白,并对其进行酶体外生化表征研究其生化反应机理,详细阐明其在MPA异戊烯基侧链合成过程中的催化作用。结果:1.在P.griseofulvum中鉴定了MPA生物合成基因簇mpa,大小为25.5 kb,其中7个编码基因序列均与短密青霉菌P.brevicompactum中mpa基因簇中基因序列高度一致。2.通过系统进化树分析表明,MpaA与Coq2、UbiA和LePGT1等同属于膜依赖的异戊烯基转移酶家族。MpaA敲除株中终产物MPA完全消失的同时积累化合物94,其结构鉴定为DHMP。MpaC敲除株体内喂养DHMP实验表明其为MPA生物合成途径中间体。3.在Saccharomyces cerevisiae FY∷MpaA工程菌中喂养DHMP后,产生化合物95,其结构鉴定为6-法尼基-5,7-二羟基-4-甲基苯酞(6-farnesyl-5,7-dihydroxy-4-methylphthalide,FDHMP),该实验结果说明,MpaA是DHMP的C2位法尼烯基焦磷酸(farnesyl diphosphate,FPP)转移酶。进一步体外生化结果显示,MpaA具有底物宽泛性,MpaA不但可以选择FPP,也能催化牻牛儿烯基焦磷酸(geranyl diphosphate,GPP)与DHMP结合形成化合物101。4.MpaH敲除株中MPA并未完全消失(说明MpaH可能并不参与MPA的生物合成),但积累了化合物102和103,其结构分别为C5侧链末端羧基和C6侧链末端羰基的MPA衍生物。MpaC敲除株化合物体内喂养结果表明,102和103均无法回补MPA的产生,说明该2个化合物是MPA生物合成途径中的副产物。5.MpaB敲除株积累化合物FDHMP和FDHMP的苯环C-3位羟基甲基化产物104。MpaC敲除株体内喂养FDHMP和104证明其均为MPA生物合成途径中间体。6.在S.cerevisiae BJ5464∷MpaB工程菌中喂养FDHMP和104后,分别产生新化合物105、106和107、108。105和106结构中侧链末端分别为羧基和羟基。Time course实验表明,MpaB催化FDHMP同时产生化合物105和106,其中105为主要产物。同时,MpaC敲除株体内喂养105和106证明其均为MPA生物合成途径中间体。以上实验结果表明,MpaB负责催化MPA异戊烯基侧链的断裂。7.MpaB催化底物宽泛性的实验结果显示MpaB不能与MXH-12和MXH-14发生催化反应,但其能催化ZGJ-7/8/9分别断裂形成新化合物109’/110’/111’。结论:P.griseofulvum中MPA生物合成基因簇mpa的鉴定,以及MpaA/B/H三个基因和蛋白体内和体外功能验证的研究,初步阐明了MPA异戊烯基侧链的生物合成机理。1)膜依赖异戊烯基转移酶MpaA催化DHMP(94)法尼烯基焦磷酸化(FPP)修饰生成FDHMP(95);2)未知功能蛋白MpaB负责催化FDHMP(95)和104的FPP侧链末端烯键的碳碳键断裂形成羧基和羟基化产物;3)之前预测的催化碳碳键断裂的基因MpaH,通过体内基因敲除实验证明其可能并不参与MPA的最终形成。MpaA体外生化功能的确证,不但丰富了真菌来源的膜依赖型异戊烯基转移酶家族的功能,而且为今后利用酶法合成新的霉酚酸类衍生物提供了改造工具。未知功能蛋白MpaB生化功能的发现,不但揭示了MPA生物合成中隐藏的异戊烯基侧链断裂过程,而且拓宽了自然界中催化碳碳键断裂的生物酶资源。更重要的是,MpaB能催化各种聚酮-倍半萜类杂合化合物C15长度的异戊烯基侧链的断裂,为其应用于其他天然产物的改造提供可能。但是,MpaB催化底物的断裂产物如何形成DMMPA或MPA还未知,后续我们将进一步完善以阐明MPA的完整生物合成途径。