背景:机体中遭受病原体感染或者出现组织损伤过程中会释放出核酸。在正常情况下,体内的Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)识别外界入侵的病原微生物的核酸,并激活天然免疫系统以保护机体免受病原微生物损害。但在病理情况下,机体持续的对自身核酸产生天然免疫应答会导致多种多样的自身免疫性疾病。TLRs家族中,Toll样受体9(Toll like receptor 9,TLR9)主要识别双链DNA,当机体内包含自身双链DNA的免疫复合物清除障碍时,会异常激活TLR9,触发天然免疫系统对内源性核酸产生过度的免疫应答反应,从而出现系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)疾病。另外,前人研究报道全血细胞的TLR9表达与SLE患者C3相关,且应用TLR9激动剂治疗时,患者出现血小板减少症(thrombocytopenia,TCP)的风险增加,但是,关于TLR9如何参与SLE合并血小板减少症(TCP-SLE)目前尚不清楚。因此,尽管SLE中关于TLR9的研究很多,但关于TLR9在SLE疾病中的作用、新的信号通路以及在TCP-SLE亚型中TLR9通过何种途径参与疾病这些方面尚缺乏深入研究。可以确定的是,TLR9在自身免疫性疾病SLE中的扮演着关键性角色,深入研究TLR9的临床价值及TLR9相关信号通路在系统性红斑狼疮及其亚型中的作用机制是一项具有深刻意义的研究课题。目的:检验TLR9相关信号通路TLR9/TGF-β1/PDGF-B在SLE患者和TLR9/TGF-β1/C3在TCP-SLE中的表达情况,深入探讨TLR9的表达水平在SLE患者中的临床价值,尤其是TLR9与SLE患者2年内的预后相关性。方法:在临床观察性研究中,选取初诊的SLE患者(n=112)及其亚型TCP-SLE患者(n=38),同时选取年龄、性别匹配的健康对照,详细记录临床疾病活动性指标、血液学、生化等指标,应用q RT-PCR方法检测全血细胞的TLR9、TGF-β1、PDGF-B和C3等基因的m RNA表达水平,应用ELISA方法检测TLR9、TGF-β1、PDGF-B等因子的血浆蛋白水平,并跟踪随访SLE患者,记录疾病活动性情况及SLE患者2年内的预后情况。结果:1.SLE患者外周血中TLR9、TGF-β1和PDGF-B的水平高于正常人:SLE患者外周血细胞中TLR9的m RNA水平显著高于健康对照组(p=0.0048),血浆中TGFβ1和PDGF-B蛋白水平明显高于健康对照组(p<0.0001和p=0.0084)。经过免疫调节治疗后,随着SLE患者的疾病活动度评分SLEDAI明显下降,治疗后的TGF-β1和PDGF-B m RNA水平较治疗前也明显下降(p<0.0001和p=0.0255)。2.正常人与SLE患者中TLR9、TGF-β1和PDGF-B三者彼此间均显著相关:健康人外周血中PDGF-B的蛋白水平与TGF-β1蛋白水平相关(p<0.0001,r=0.61),SLE患者外周血中PDGF-B的蛋白水平与TGF-β1蛋白水平也具有明显的相关性(p<0.0001,r=0.68);同时,在健康人和SLE患者中TGF-β1 m RNA水平均与PDGF-B m RNA水平正相关(健康人,p=0.0268,r=0.33;SLE患者p<0.0001,r=0.61);而且,在健康人中TLR9和TGF-β1的m RNA水平具有显著正相关性(p=0.0003,r=0.51),TLR9和PDGFB的m RNA水平也具有显著正相关性(p=0.0018,r=0.45);同样,在SLE患者中也存在相似的情况,TLR9和TGF-β1的m RNA水平具有显著正相关性(p<0.0001,r=0.52),TLR9和PDGF-B的m RNA水平也具有显著正相关性(p<0.0001,r=0.45)。3.升高的TLR9 m RNA水平与这些升高的MCP-1、ISG15和IFNα的m RNA之间并不存在相关性:我们检测TLR9 m RNA的表达是否与其他已知的因子相关或者存在网络通路。初诊的活动期SLE患者中,MCP-1、ISG15和IFNα的m RNA水平显著高于正常人(MCP-1,p=0.0039;ISG15,p=0.0004;IFNα,p=0.0073)。然而,我们的结果显示升高的TLR9 m RNA水平与这些升高的MCP-1、ISG15和IFNα的m RNA之间并不存在相关性(TLR9与MCP-1,p=0.2544,r=0.1091;TLR9与ISG15,p=0.9722,r=-0.0072;TLR9与IFNα,p=0.1247,r=-0.3549)。4.TLR9激活后能刺激TGF-β1和PDGF-B的m RNA表达水平升高:在正常人(TGF-β1,p=0.0210;PDGF-B,p=0.0093)与SLE患者(TGF-β1,p=0.0005;PDGF-B,p=0.0005)中,Cp G均可以显著上调TGF-β1和PDGFB的m RNA表达。但是,Cp G对于SLE患者的全血细胞诱导产生的TGF-β1m RNA显著多于Cp G对于健康人全血细胞诱导产生的TGF-β1 m RNA(p=0.0485),同时,Cp G对于PDGF-B的诱导也存在同样的现象(p=0.0037)。而对于CD14+的单核细胞,我们体外培养并给予Cp G刺激后也发现存在同样的现象,即,Cp G刺激SLE患者CD14+单核细胞产生的TGF-β1和PDGFB m RNA均显著高于健康人。5.TGF-β1能够诱导PDGF-B产生:在全血细胞培养体系中加入了重组人TGF-β1蛋白,结果发现重组人TGF-β1蛋白能够显著增加PDGF-B的m RNA(p=0.0156,)和蛋白水平(p=0.0020);相反,我们在培养体系中加入TGF-β1拮抗剂,则可以显著抑制PDGF-B的m RNA(p<0.05)和蛋白表达(p<0.05)。6.PDGF-B能够刺激肾小球系膜细胞增殖:SLE患者原代血细胞经过Cp G刺激培养后的上清液能够显著诱导系膜细胞增殖(p=0.0171)。另外,SLE患者的血浆对于系膜细胞的诱导增殖程度明显高于健康人血浆(p=0.0116)。同时,应用抗PDGF-B中和抗体能够抑制SLE患者血浆诱导的系膜细胞增殖,并且这种抑制是呈剂量依赖性的(p<0.05)。7.PDGF-B与SLE患者并发狼疮肾炎(lupus nepheritis,LN)有关:在m RNA水平发现LN患者全血细胞中TGF-β1与PDGF-B正相关(p=0.0092,r=0.61),TLR9与TGF-β1正相关(p=0.0003,r=0.51),TLR9与PDGFB正相关(p=0.0052,r=0.44)。而且,这些LN患者的血浆中TGF-β1和PDGF-B蛋白水平也呈正相关((p<0.0001,r=0.64)。另外,PDGF-B血浆蛋白水平与尿蛋白定量显著相关(p<0.0027,r=0.49)。8.合并TCP的SLE患者全血细胞中C3、TLR9和TGF-β1基因表达增加:TCPSLE患者的血浆C3水平显着低于非TCP-SLE患者的水平(p=0.005)。相反,C3 m RNA表达的水平却显著升高(p<0.01)。此外,TCP-SLE患者全血细胞的TLR9和TGF-β1m RNA表达水平也显着高于非TCP-SLE患者(TLR9和TGF-β1的p<0.05)。9.TCP-SLE患者的临床指标与TLR9、TGF-β1和C3的相关性:TCP-SLE患者TLR9 m RNA在高滴度抗ds DNA抗体组的水平显着高于低滴度抗ds DNA抗体组中的水平(p<0.05)。此外,血浆C3的水平与SLEDAI评分和抗ds DNA抗体的滴度负相关(SLEDAI的r=-0.33,p=0.0411;抗ds DNA抗体滴度的r=-0.37,p=0.0207)。血浆C3水平与全血细胞中C3 m RNA的相对水平负相关(r=-0.41,p=0.0113),但与TCP-SLE患者的血小板计数呈正相关(r=0.37,p=0.0211)。此外,TCP-SLE患者全血细胞中在m RNA水平TGF-β1与TLR9正相关(r=0.62,p<0.0001)和C3正相关(r=0.45,p=0.0043)。10.经过免疫调节治疗后,缓解的患者全血细胞中TLR9、TGF-β1和C3 m RNA的水平显着低于治疗前的基线水平(均p<0.05)。11.应用Cp G刺激共培养的TCP-SLE患者全血细胞中TGF-β1的基因和蛋白水平均显著增加。应用TGF-β1刺激可以显着增加C3的基因和蛋白表达,而应用SB431542(TGF-βRI/ALK抑制剂)刺激则显着降低C3的基因和蛋白表达。此外,应用Cp G激活TLR9后也显着增加了全血细胞中C3表达的水平,并且可以通过SB431542的共培养完全抑制TLR9上调C3的效应。12.我们的临床队列研究发现,SLE患者的全血细胞中TLR9 m RNA水平明显升高,并且在SLEDAI亚组、抗ds DNA抗体亚组和C3亚组中存在显著差异,但在肾受累亚组中无差异。13.高水平TLR9 m RNA与SLE不良预后独立相关:在2年随访期间,52例(57.8%)患者出现临床缓解并一直持续良好,其余38例(42.2%)分别在不同时间出现不良预后。单因素分析显示基线时24小时尿蛋白定量>0.5g(HR,3.81;95%CI,1.96-7.40),低血清C3水平(HR,0.31;95%CI,0.09-0.98),SLEDAI水平(HR,1.05;95%CI,1.02-1.09),C-反应蛋白水平(HR,1.006;95%CI,1.001-1.012)和高TLR9 m RNA水平(HR,3.60;95%CI,1.88-6.89)均预示着2年随访期内可能出现不良预后。多变量分析调整后,持续性蛋白尿(>0.5g/天;HR,6.31;95%CI,2.86-13.95),C-反应蛋白(HR,1.013;95%CI,1.007-1.019)和高TLR9m RNA水平(HR,3.85;95%CI,1.93-7.68)是预后不良的独立危险因素,而应用多于一种免疫抑制剂治疗(HR,0.37;95%CI,0.17-0.81)则是良好预后的保护性因素。14.SLE患者基线(初次诊断时)TLR-9 m RNA水平升高组发生不良预后的中位时间为诊断后6个月(范围,0-13.83个月)。Kaplan-Meier生存曲线表明,低-TLR9组SLE患者治疗2年时出现预后良好的概率为66%(95%CI,54.2-77.8),而高-TLR9组SLE患者治疗2年时出现预后良好的概率为30%(95%CI,10.4-49.6),SLE患者初诊基线高-TLR9 m RNA水平组出现预后不良的概率是基线低-TLR9 m RNA组的3.85倍(HR,3.85;95%CI,1.93-7.68;P=0.000)。15.预后不良的SLE患者2年后TLR9 m RNA仍保持较高水平:不良预后组的基线TLR9 m RNA水平显著高于预后良好组(P<0.0001)。与基线水平相比,2年后预后良好组TLR9 m RNA水平显着降低(P<0.0001),但预后不良组(P=0.1192)中TLR9 m RNA水平仍然较高。结论:1.人类外周血细胞中存在TLR9/TGF-β/PDGF-B通路,并且在SLE患者的外周血中过度激活。且该途径参与肾小球肾炎发病机制,这有助于临床理解LN的病理过程,并由此可以研发TLR9、TGF-β或PDGF-B拮抗剂,以早期预防、控制肾小球纤维化和LN的肾功能恶化。2.外周血细胞是TCP-SLE患者C3的肝外合成来源,并且外周血C3的肝外合成能够被TLR9通过诱导TGF-β1上调。TLR9/TGF-β1/C3途径有可能参与SLE患者中血小板减少的病理过程,但尚需要进一步深入的研究。3.队列研究表明TLR9参与SLE发病机制,与疾病活动相关,并且可能预测2年内的SLE预后结局。这表明在SLE初次诊断时的TLR9 m RNA明显升高的患者短期内可能会出现不良预后,有助于提示临床医生加强对这类患者进行更频繁的临床监测。TLR9可能会成为一个用于预测SLE预后的非常有用的生物标志物。