第一部分:化学缺氧对滋养细胞中TRPC6表达的影响目的:研究应用化学试剂二氯化钴(CoCl2)来构建化学缺氧模型后,绒毛外滋养细胞(本研究中应用的是JEG3)中瞬时感受器阳离子通道蛋白6(transient receptor potential channel 6,TRPC6)表达的改变,以及细胞内外钙离子平衡的变化,探讨细胞缺氧后TRPC6的表达及其在子痫前期发病机制中的相关作用。方法:1.绒毛外滋养细胞选取JEG3细胞株2.采用化学物质二氯化钴(CoCl2)建立JEG3细胞化学缺氧模型,将细胞分为3组进行处理,以缺氧时间不同来分组,分为对照组,缺氧24h和缺氧48h组。3.采用实时的荧光定量pcr来检测各组TRPC6的mRNA含量,westen-blot的方法检测各组TRPC6蛋白的表达情况,采用fluo-3来检测细胞内钙离子的浓度变化。结果:1.在缺氧存在的条件下,TRPC6 mRNA表达增加,并且在缺氧24和48小时均增加明显。此时,与对照相比,暴露于缺氧环境中的JEG3细胞,它的TRPC6mRNA的表达量增加大约9倍。RT-PCR的实验揭示了同一批细胞中缺氧组和对照组之间TRPC6 mRNA,存在显著差异(P<0.005)。2.在缺氧24h和48h时,使用Western Blot方法,检测JEG3细胞中的TRPC6表达,我们发现在缺氧24h和48h时,TRPC6的蛋白表达水平均升高,且与对照组相比有显著差异(P<0.005)。并且TRPC6蛋白表达水平在缺氧后随时间增加保持在稳定水平。3.在本研究中,我们使用了荧光探针Fluo-3/AM来标记细胞内的钙离子,用Pro-plus图像的分析软件来分析荧光图像,用平均光密度(IOD SUM/areaSUM)来表示每组中钙离子的浓度。结果表明,正常条件下,图片均显示相似的低荧光强度。而缺氧细胞的Fluo-3/AM的荧光强度增加,表明TRPC6高表达可能导致细胞内游离钙的变化。结论:应用二氯化钴进行化学缺氧培养时,JEG3细胞的TRPC6表达增加,同时细胞内的钙离子浓度也相应的增加。我们用JEG3细胞系建立了缺氧诱导的TRPC6高表达的细胞模型,发现缺氧可以诱导TRPC6高表达,而缺氧本身就是子痫前期发病的重要原因,因此我们可以认为该细胞模型与子痫前期患者体内滋养细胞有相似之处,应用它我们可以进一步解释TRPC6高表达的作用。第二部分过表达TRPC6蛋白对JEG3生物学行为的影响及其在子痫前期发病机制中的研究目的:探究TRPC6蛋白对这滋养细胞(JEG3)的增殖、凋亡的影响,进而再探讨TRPC6对子痫前期的滋养细胞模型的生物学行为的影响及其在子痫前期中发病的机制的作用。方法:1.利用慢病毒包装含有rs3824934序列的过表达TRPC6蛋白干预正常培养条件下绒毛外滋养细胞JEG3。2.荧光显微镜下观察慢病毒转染情况,检测转染效率达80%以上,遂对携带有TRPC6蛋白的绒毛外滋养细胞JEG3继续培养。3.采用荧光定量的pcr检测各组细胞中的TRPC6的表达情况,再次验证过表达实验是否成功。对确定了TRPC6蛋白过表达的细胞应用荧光定量的pcr检测凋亡因子caspase3、12表达的情况,再利用western blot的方法检测来各组细胞不同蛋白的表达情况。应用CCK8的检测方法来检测滋养细胞的增殖改变情况。结果:1.将携带有TRPC6过表达的蛋白转染后分别将空白组与阴性对照结果及阴性对照与TRPC6过表达组结果进行统计学分析,发现前一组之间无明显差异,(t=2.061,p(29)0.05),而阴性对照组与TRPC6过表达组之间差异显著(t=9.390,p(27)0.05),提示慢病毒转染成功。2.过表达TRPC6后,与阴性对照组相比,凋亡因子caspase3及caspase12 mRNA表达也相应的增加,前者增加约32倍,后者增加约8倍。RT-PCR实验揭示了同一批细胞中的TRPC6过表达组和阴性对照组之间caspase3(t=14.97,p(27)0.05)及caspase12(t=6.827,p(27)0.05)的表达有显著差异。3.在获得TRPC6过表达稳转株后,使用Western Blot方法分别检测两组细胞中的caspase3及caspase12蛋白表达情况,发现在TRPC6过表达组caspase3(t=13.08,p(27)0.05)及caspase12(t=15.45,p(27)0.05)蛋白表达水平均升高,且与阴性对照组相比有显著差异。4.CCK8细胞增殖实验结果显示:与阴性对照组相比,TRPC6过表达组滋养细胞OD值均显著降低,差异具有统计学意义(t=5.378,P<0.05)。并且我们还发现滋养细胞增殖能力与培养时间长短有关,培养24h时,滋养细胞OD值最高,其增殖能力最强,随后随着培养时间延长,滋养细胞OD值逐渐降低,其增殖能力逐步降低,差异具有统计学意义(one-way ANOVA,F=40.76,p(27)0.05)。结论:在本阶段中我们将携带有过表达TRPC6蛋白的慢病毒转染至滋养细胞内,获取过表达该蛋白的细胞稳转株。进而对稳转株进行分析检测,我们发现过表达TRPC6蛋白后,细胞中凋亡因子表达明显升高,细胞凋亡因子的表达升高,相应的即提示细胞凋亡数量的增加,而绒毛外滋养细胞的增殖的能力则明显下降,因而我们可以推测TRPC6可能是通过影响滋养细胞的增殖和凋亡能力,进而导致胎盘浅着床,影响胎盘的血管的重塑,导致患者高血压的发生,从而参与子痫前期的发生。