论文部分内容阅读
研究背景和目的:结直肠癌已成为消化系统中最常见的恶性肿瘤,给全世界造成了巨大的疾病负担。尽管结直肠癌的诊治取得了一定的进展,但由于其发病率呈逐渐上升趋势且发病年龄趋于年轻化,导致我们对该疾病的诊断和防治带来很大困难。因此,寻找有效的诊断标志物和治疗靶点对于结直肠癌的早期诊治具有重大的意义。可变剪接是通过调控基因不同转录本的形成和编码蛋白的表达进而维持正常的生物学功能,而异常的可变剪接调控被认为是新的肿瘤标志性事件,既往研究证实剪接相关因子基因的异常表达是导致肿瘤发生发展的重要原因。我们通过生物信息学分析,发现CLK2是结直肠癌中核心的剪接相关因子基因。本研究通过检测结直肠癌中CLK2的表达并分析其与患者临床病理学参数及预后的关系,深入研究CLK2对结直肠癌细胞生物学功能的影响,并探讨其可能的分子作用机制,旨在为结直肠癌的临床诊治提供一个新的干预靶点。方法:1、通过整合TCGA数据库中结直肠癌样本表达谱数据和剪接相关因子基因列表,应用NMF聚类分析方法对样本进行分型,并使用GSE17536数据集进行验证;通过联合三种机器学习算法共同鉴定结直肠癌中核心的剪接相关因子基因。2、采用qRT-PCR和Western blotting分别检测64对新鲜结直肠癌组织及癌旁组织中CLK2的表达水平;应用免疫组织化学方法检测120例结直肠癌组织中CLK2蛋白的表达情况,并根据免疫组织化学染色评分结果分析CLK2蛋白表达水平与结直肠癌患者临床病理学参数的相关性。3、采用qRT-PCR和Western blotting检测CLK2在6种结直肠癌细胞系和正常肠上皮细胞的表达情况;分别选取两株表达较高和较低的细胞构建CLK2干扰稳转株和过表达稳转株;通过CCK8实验、Ed U实验、平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell细胞迁移侵袭实验、检测EMT相关标志物和细胞成管实验观察CLK2在体外对结直肠癌细胞增殖、迁移侵袭和血管新生的影响。4、通过构建裸鼠皮下成瘤和肝转移模型评估CLK2在动物体内对结直肠癌细胞成瘤和转移的影响。5、通过对CLK2高表达和低表达组的差异基因进行基因集富集分析,并采用Western blotting检测CLK2参与调控信号通路蛋白的表达情况。6、通过构建过表达标签质粒,应用蛋白质免疫共沉淀联合质谱技术鉴定分析CLK2的互作蛋白,并利用免疫共沉淀和细胞免疫荧光实验进一步验证各蛋白之间的互作关系。结果:1、根据剪接相关因子基因,通过NMF聚类分析法将TCGA数据库中结直肠癌样本分成C1和C2两种亚型,并且该分型结果同样在验证集GSE17536中得到验证;差异分析结果表明C1和C2亚型间具有显著的生存差异;进一步通过综合三种机器学习算法共鉴定出6个核心的结直肠癌剪接相关因子基因,其中CLK2是差异最为显著的基因。2、qRT-PCR和Western blotting结果显示:结直肠癌组织中CLK2的表达水平显著高于癌旁组织,差异具有统计学意义（p＜0.05）;免疫组化结果显示:CLK2蛋白表达的增高与结直肠癌患者病理分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移存在相关性（p＜0.05）,且与结直肠癌患者的不良预后密切相关（p＜0.005）。3、CLK2在结直肠癌细胞中表达均增高,我们选用表达水平较高的SW480和SW620细胞用于构建干扰CLK2表达稳转株,HCT8和HCT116细胞因表达水平较低被应用于构建CLK2过表达稳转株;通过CCK8实验、Ed U实验和平板克隆形成实验结果表明,相对于对照组,过表达CLK2能够显著促进细胞增殖（p＜0.05）;细胞划痕实验、Transwell细胞迁移侵袭实验和EMT相关标志物检测结果表明,与对照组相比,过表达CLK2可促进细胞的迁移和侵袭（p＜0.05）;进一步通过细胞成管实验结果表明,与对照组比较,过表达CLK2能明显促进血管新生（p＜0.05）;相反,干扰CLK2的表达则起到抑制作用。4、动物体内实验结果表明,过表达CLK2组的结直肠癌细胞较对照组能够显著增强细胞的成瘤能力（p＜0.05）,免疫组化结果显示瘤体内具有较高的Ki-67表达;除此之外,过表达CLK2的结直肠癌细胞也具有更强的转移能力;而干扰CLK2的表达则抑制了结直肠癌细胞的成瘤和转移能力。5、基因集富集分析结果显示CLK2可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控结直肠癌的进展,Western blotting结果表明:过表达CLK2能够促进β-catenin总蛋白的增加和核内β-catenin的积累。6、通过蛋白质免疫共沉淀联合质谱分析发现SRSF7是差异显著的蛋白分子,可能是CLK2的互作分子;通过内源性和外源性免疫共沉淀实验证实CLK2与SRSF7存在蛋白互作关系,并进一步通过细胞免疫荧光验证了二者在空间结构上的高度共定位现象,其相关性系数大于0.85。结论:CLK2在结直肠癌组织中表达增高,与结直肠癌患者的病理分期和肿瘤浸润深度等临床病理学参数呈正相关,且CLK2高表达的结直肠癌患者具有较差的预后,有望作为结直肠癌的预后指标。体内外实验研究证实CLK2能够促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移等多种恶性生物学行为,表明CLK2在结直肠癌中发挥着促癌作用。另外,CLK2可通过调控Wnt/β-catenin信号通路介导结直肠癌的进展,并且CLK2与SRSF7存在的蛋白互作关系可能是结直肠癌治疗的潜在靶点。