应用基因芯片筛选初发、复发鼻咽癌相关基因

来源 :温州医学院 温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiaoquan1234
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目的:应用基因芯片研究初发鼻咽癌(PrimarynasopharyngealcarcinomapNPC)、复发鼻咽癌(RecurrencenasopharyngealcarcinomarNPC)相关基因的表达和功能,探讨基因芯片技术在筛选初发、复发鼻咽癌相关基因中的应用价值。   方法:(1)标本来源及实验分组以8例初发鼻咽癌、5例复发鼻咽癌、3例正常鼻咽黏膜组织为研究对象,实验分两组,一组为3例初发鼻咽癌和5例复发鼻咽癌,另一组为3例正常鼻咽黏膜和5例初发鼻咽癌;标本活检后1份送病理检查,1份马上放液氮中冻存备用,三种组织标本均经过病理组织学检查证实。(2)总RNA的提取和质量判定:两组分别提取标本的总RNA,用分光光度计测量RNA浓度和纯度,判定所提取的为高质量的总RNA,然后-80℃保存备用。(3)探针标记利用反转录聚合酶链反应PCR,经两轮逆转录成cDNA后,纯化cDNA和段化单链DNA片,加入试剂到片断化的DNA中,混匀,取2μl样品检测标记效率。(4)杂交、洗涤在1.5ml离心管中准备杂交液,混匀,离心,杂交后在AffymetrixFluidicsStation450洗涤站中洗涤,每例标本重复三次。(5)扫描与分析芯片经严格洗片后用GenearrayScanner3000扫描,读取每张芯片每一位点的表达值,扣除背景信号,经GCOS软件处理后自动分析每一基因位点的表达参数并给出参考值,输出数据,设定筛选条件为:以组间2倍以上差异表达为条件且P<0.001,分别对pNPC与正常鼻咽粘膜和rNPC与pNPC两组差异表达基因进行筛选。(6)逆转录聚合酶链式反应验证(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReactionRT-PCR)随机选择4个感兴趣的基因(S100A9、KRT6B、LSAMP、TNFAIP3),内参采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehydephosphatedehydrogenaseGAPDH),进行RT-PCR验证基因芯片结果的准确性。   结果:两组实验检测结果均存在大量差异表达基因,与pNPC相关差异基因394个,其中上调2倍以上161个,下调2倍以上233个;差异基因功能涉及蛋白结合和钙离子结合(102/394,25%)、酶活性(72/394,18%)、免疫(38/394,10%)、通道和跨膜转运(22/394,6%)、肿瘤坏死因子(15/394,4%)、趋化因子(13/394,3%)、细胞周期(12/394,3%)等;与rNPC相关差异基因104个,其中上调2倍以上89个,下调2倍以上15个;差异基因功能涉及蛋白结合和钙离子结合(45/104,42%)、酶活性相关(19/104,18%)、细胞外基质(9/104,9%)、通道和跨膜转运(7/104,7%),免疫(5/104,5%)、受体活性(4/104,4%)、细胞骨架(3/104,3%)等;筛选出可能与pNPC、rNPC癌变相关基因;随机选择的4个基因RT-PCR结果与基因芯片检测结果基本一致。   结论:(1)pNPC、rNPC的发生和发展是多个基因的结构和功能异常改变的结果,本试验发现与pNPC相关差异基因功能涉及蛋白结合和钙离子结合、酶活性、免疫、通道和跨膜转运、肿瘤坏死因子、趋化因子等;与rNPC相关差异基因功能涉及蛋白结合和钙离子结合、酶活性相关、细胞外基质、通道和跨膜转运,免疫、受体活性、细胞骨架等。(2)基因芯片技术为研究筛选pNPC、rNPC癌变过程可能相关基因提供一种可靠方法,有助于从分子水平阐明其发病、复发机制,进一步发现新的分子诊断指标和基因治疗靶标。
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