论文部分内容阅读
目的观察行气活血法代表性中药预知子种子提取物干预SMMC-7721和Hep G2肝癌细胞后,对肝癌恶性增殖的抑制作用及部分核糖体相关蛋白基因表达的影响,筛选部分可能的关键基因进行深入研究,以明确预知子种子提取物抑制肝癌恶性增殖的部分作用靶点和机制,加深对中医行气活血法的认识。方法1.预知子种子提取物对肝癌细胞核糖体蛋白相关基因的作用研究。在前期实验预知子种子提取物干预SMMC-7721和Hep G2人肝癌细胞后得到的基因芯片结果中,筛选部分表达量大且变化明显的基因进行PCR验证,以明确其表达变化情况,并与正常肝细胞的基因表达进行对比,筛选可能的关键基因3～5个进入后续研究;2.部分核糖体蛋白相关基因在肝癌细胞中的作用研究。利用sh RNA技术和c DNA技术对上述基因进行沉默和过表达,利用PCR技术和Western blot技术验证基因沉默和过表达效果及,利用MTT技术观察基因沉默和过表达对对细胞生长活力的影响,利用流式细胞术观察基因沉默和过表达对细胞周期和凋亡的调控情况;Western blot技术观察基因沉默后其他入选基因蛋白的表达情况;3.预知子种子提取物通过核糖体蛋白相关基因抑制肝癌细胞恶性增殖的作用机制研究。利用Western blot技术检测上述核糖体蛋白所涉及到的Mdm2-p53信号通路的及MAPK信号通路关键蛋白表达,检测关键周期蛋白表达并与流式细胞仪检测细胞周期进行对比,以探索其部分作用途径和机制。结果1.高浓度预知子种子提取物(750μg/ml)干预7721和Hep G2肝癌细胞后,细胞的生长活活力受到显著抑制,RTq PCR检测RPS3A、RPS8、RPS13、RPS16、RPS29、RPSA、RPL6、RPL10、RPL15,RPL17、RPL19和RPLP0等基因m RNA水平在两种细胞种都表现显著下调。RPS26和RPS6KA3存在例外的情况。RPS26在Hep G2中,预知子干预后反而表达上升。RPS6KA3在7721细胞中表达随剂量上升而上升,在Hep G2中表达随及量上升而下降。与L-02正常肝细胞相比,RPSA和RPS26在7721和Hep G2细胞中一致下调。因此我们推测RPS6KA3、RPS26和RPSA可能在预知子抑制肝癌细胞恶性增殖中发挥重要作用。2.我们在两种细胞种分别对RPS6KA3、RPS26和RPSA三个基因进行沉默和过表达,MTT结果显示,在7721细胞中,RPS6KA3基因沉默抑制细胞生长,过表达促进细胞生长;RPS26基因沉默促进细胞生长,过表达抑制细胞生长;RPSA过表达促进细胞生长。但在Hep G2细胞中,RPSA基因沉默可促进细胞生长。各组均未见细胞周期和凋亡发生显著变化。虽然MTT结果显示细胞增殖显著变化,但是变化幅度有限(<10%),且与预知子干预结果变化趋势并不一致,我们认为RPS6KA3、RPS26和RPSA三个基因并不是预知子作用的直接靶点。3.预知子干预后在RPS26和RPSA蛋白显著下调的同时,Mdm2蛋白也显著下调,在Hep G2细胞种p53表达被激活,细胞进入S期周期阻滞。在7721细胞中,则见p53 m RNA水平显著降低,细胞进入G2/M周期阻滞。在两种细胞中均可见CCND2和CREB蛋白表达下降。结论1.预知子在抑制肝癌细胞增殖的同时,RPS3A、RPS8、RPS13、RPS16、RPS29、RPSA、RPL6、RPL10、RPL15,RPL17、RPL19和RPLP0等核糖体蛋白m RNA水平降低。2.尽管RPS6KA3促进7721细胞增殖、RPS26抑制7721细胞增殖、RPSA促进7721细胞增殖抑制Hep G2细胞增殖,但RPS6KA3、RPS26和RPSA并不是预知子种子提取物抑制肝癌细胞增殖的直接作用靶点。3.预知子种子提取物可能通过抑制CREB和CCND2表达、抑制Mdm2和p53蛋白表达、诱导细胞G2期细胞周期停滞等途径,起到调控核糖体蛋白m RNA及蛋白水平、抑制7721肝癌细胞增殖的作用。4.预知子种子提取物可能通过抑制CREB和CCND2表达、抑制Mdm2激活p53、诱导细胞S期周期停滞等途径,调控核糖体蛋白m RNA及蛋白水平,以抑制Hep G2细胞增殖。