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目的:细胞内约80%的蛋白经泛素蛋白酶体系统降解,E3连接酶在UPS中决定了底物特异性,充当泛素与底物空间接近的脚手架结构。其中CUL4A和CUL4B组成了CUL4家族,虽然两个分子同源相似性达到近80%,但二者在其细胞定位及功能上各有特色,同时因CRL4s中不同的底物受体呈递不同的底物,使得CUL4A和CUL4B在不同的生物刺激下及不同的细胞定位中发挥不尽相同的作用,增加了CRL4s的生物功能多样性。近年的研究表明,肿瘤中CUL4参与细胞周期调控、细胞凋亡、转录调控、DNA损伤修复、表观遗传学稳定性等多种生物学过程。CUL4在多种肿瘤中存在异常高表达,并与肿瘤进展、转移、不良预后相关,如:乳腺癌、前列腺癌、鳞癌、肾上腺皮质腺癌、肝癌等。我们前期研究发现CUL4在肺癌中高表达,且与吸烟指数、肿瘤高级别分期及不良预后相关。另外,在敲降CUL4的肺鳞癌和小细胞肺癌小鼠皮下成瘤实验中发现,降低CUL4表达后,肿瘤生长明显受到抑制。以上研究结果表明CUL4在肺鳞癌及小细胞肺癌进展过程中发挥了非常重要的作用。本研究旨在通过细胞学实验探索CUL4对肺鳞癌及小细胞肺癌的生长调控及凋亡调控的机制,为肺鳞癌及小细胞肺癌潜在治疗靶点提供有力证据。方法:1.通过免疫印迹技术筛选高表达CUL4A及CUL4B的肺鳞癌及小细胞肺癌细胞株后,应用慢病毒质粒系统转染并包装成能够敲降CUL4A和CUL4B表达的病毒液,构建稳定低表达CUL4A、CUL4B的肺鳞癌及小细胞肺癌细胞株模型各2株。通过免疫印迹和实时荧光定量PCR技术检测筛选构建的稳系中CUL4A、CUL4B的蛋白水平和RNA水平的表达情况。并应用细胞镜下计数法观察降表达CUL4A和CUL4B后细胞增殖速度的变化情况。2.通过PI单染法检测沉默CUL4A、CUL4B蛋白后对肺癌细胞系细胞周期的影响。同时,提取同批次细胞总蛋白检测P21及cyclin E1蛋白水平在CUL4A敲降后的变化情况。进一步通过流式细胞方法检测沉默P21后对CUL4A敲降引起的细胞周期阻滞现象的挽救作用。3.通过Annexin V-FITC/PE法检测敲降CUL4A、CUL4B蛋白后对肺癌细胞系细胞凋亡的影响。提取同批次细胞总蛋白检测凋亡相关蛋白及抗凋亡相关蛋白在稳定敲降CUL4A、CUL4B后的变化。IHC法及免疫印迹法分别检测肺鳞癌及小细胞肺癌组织中CUL4B与FOXO3A蛋白相关性和细胞中FOXO3A及P-FOXO3A在敲降CUL4B后的变化情况。另外,在敲降CUL4B的基础上RNA沉默FOXO3A后观察肺癌细胞系凋亡情况的变化,以确定FOXO3A对肺癌细胞凋亡的调控作用。4.利用免疫印迹法检测ERK通路活性在CUL4B敲降后的变化情况,并通过PD98059的抑制实验检测P-FOXO3A的蛋白水平以验证ERK通路对FOXO3A的磷酸化调控。应用MG132、MLN4924及沉默UBC12等方法确定P-FOXO3A通过UPS途径降解,且非CUL4B介导。5.通过查阅文献及细胞学实验排除LATS1在肺鳞癌及小细胞肺癌中参与CUL4B调节ERK活性,最终结合文献、质谱检测及细胞学实验发现P16可能受CUL4B的转录抑制,同时,在敲降CUL4B的基础上RNA沉默P16后发现ERK通路活性恢复,验证了CUL4B通过可能转录抑制P16参与调控ERK通路活性。结果:1.敲降CUL4A和CUL4B后,肺鳞癌和小细胞肺癌增殖速度减缓。2.肺鳞癌和小细胞肺癌中,敲降CUL4A导致G1期阻滞;双敲减CULA和P21后,G1期阻滞现象被解除。3.肺鳞癌和小细胞肺癌中,敲降CUL4B导致细胞凋亡增加;双敲减CUL4B及FOXO3A能够逆转凋亡增加的现象。CUL4B低表达后,FOXO3A上调,并伴随P-FOXO3A的下调。FOXO3A的上调并非受CUL4B转录调控,而是由于CUL4B降表达后,ERK活性下调引起的磷酸化降解减少引起的。随后的P16 m RNA检测及双敲降实验结果显示,CUL4B可能通过抑制P16的转录,使P16的ERK抑制作用减弱,上调ERK活性。综上,在肺鳞癌和小细胞肺癌中CUL4B通过抑制P16的转录,上调ERK活性,促使FOXO3A磷酸化降解,从而减少细胞凋亡。结论:1.肺鳞癌及小细胞肺癌中,CUL4A和CUL4B参与细胞生长增殖及细胞凋亡调控。2.肺鳞癌及小细胞肺癌中,CUL4A通过调控其泛素化底物P21的蛋白水平影响细胞周期调控。3.肺鳞癌及小细胞肺癌中,CUL4B通过转录抑制P16的表达情况上调ERK通路活性,使FOXO3A磷酸化及泛素化降解增加,抑制其促细胞凋亡的作用,从而增强肺鳞癌及小细胞肺癌的生存能力。