【摘 要】
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海刺参溶菌酶(Sichopus japonicus lysozyme,SjLys)是一种具有糖苷酶活性和广谱、非酶抑菌活性的i型溶菌酶,是海参机体先天免疫系统中的重要防御因子。由于其具有重要的应用
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海刺参溶菌酶(Sichopus japonicus lysozyme,SjLys)是一种具有糖苷酶活性和广谱、非酶抑菌活性的i型溶菌酶,是海参机体先天免疫系统中的重要防御因子。由于其具有重要的应用价值,实验将采用枯草芽孢杆菌WB600(Bacillus subtilisWB600)在体外表达SjLys蛋白。对于目前使用的工程菌来说,枯草芽孢杆菌表达系统具有较高的应用前景。枯草芽孢杆菌具有不含内毒素、蛋白分泌能力强等优点。用其取代之前普遍采用的大肠杆菌(E.co/i)表达系统来构建海参溶菌酶工程菌,避免了大肠杆菌系统存在的蛋白质分泌在胞内形成包涵体等缺陷;同时采用整合型载体pDG1730将目的基因整合到枯草芽孢杆菌染色体上,保证了质粒在宿主中的稳定遗传。通过构建克隆质粒pMD18-P43-SjLys,将B.subtili 自身强启动子P43序列和已分离得到的 SjLys 基因(GenBank accession No.EF036468)连接(P43-SjLys)。经BamHI/EcoRI酶切,将P43-SjLys片段连到B.subtis整合载体pDG1730上,构建整合重组质粒pDG-P43-SjLys。经XhoI酶切处理,线性化的pDG-P43-SjLys质粒转化B.subtilisWB600细胞。P43-SjLys片段通过同源双交换重组整合到B.subtilis WB600染色体上,成功得到具有稳定遗传的基因工程菌B.subtilis WB600/P43-SjLys。经SDS-PAGE和抑菌实验分析表明,培养60h后,B.subtilis WB600/P43-SjLys能够表达可溶的,对常见的海洋细菌溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性的SjLys蛋白。本研究首次在B.subtilis表达系统中得到可溶且具有酶活功能的SjLys蛋白,为SjLys的生产提出了一种具有可行性的和潜力的新方法。
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