盐生杜氏藻(Dunaliella salina,以下简称盐藻)无细胞壁,为天然原生质体,由于极强的耐盐能力,简单的细胞结构以及便利的培养条件使其成为研究植物耐盐机制最理想的模式生物。促有丝分裂活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)属于丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,存在于所有真核生物中,它在植物的生长发育调节及抗逆应答等生理过程中起重要作用。因此,深入探讨盐藻MAPK基因的功能对于阐明细胞高度复杂的分子机制具有重要科学意义。本论文在实验室已获得Ds MAPK基因的基础上,开展了盐藻Ds MAPK的原核表达、反义表达和亚细胞定位分析的研究。本实验的研究方法与结果如下:1.通过PCR技术扩增Ds MAPK基因的开放阅读框(ORF),并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体p GS-21a上,成功构建重组表达载体p GS-21a-MAPK。将原核表达载体p GS-21a-MAPK导入E.coli.BL21(DE3)中,经IPTG诱导后融合蛋白在E.coli.BL21(DE3)中得到成功表达。通过SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式,结果在上清和包涵体中均有存在。上清蛋白经过GST-SefinoseTM Kit纯化后获得了纯度较高的可溶性融合蛋白,Western blot检测结果显示该融合蛋白能被抗GST单克隆抗体特异性识别,初步证明得到了纯化的GST-MAPK蛋白。2.将Ds MAPK基因的开放阅读框反向插入到植物表达载体35S启动子的下游,成功构建了反义表达载体,采用Li Ac/PEG介导法将其导入盐藻细胞。通过氯霉素筛选得到具有相应抗性的转基因盐藻,用半定量RT-PCR的方法分析高盐胁迫不同时间下转基因盐藻中Ds MAPK表达水平的变化情况,结果显示盐藻Ds MAPK基因在转录水平的表达受到明显的抑制。3.将构建成功的亚细胞定位重组载体p MDCMGN-Cat转化农杆菌GV3101感受态细胞,筛选阳性单克隆,采用农杆菌介导法转染洋葱内表皮细胞,荧光显微镜下观察Ds MAPK瞬时表达,发现融合蛋白GFP-Ds MAPK在洋葱内表皮细胞中成功表达,并且主要分布于细胞核及细胞质中。