肿瘤转移是癌症病人死亡的主要原因。肿瘤转移过程由几个独立的步骤组成,包括肿瘤细胞从原发灶脱离,肿瘤细胞侵袭到血管内皮或淋巴管从而进入循环系统,最后,在新的宿主环境中,粘附并再侵袭,增殖成为一个转移瘤。大量研究显示,在肿瘤转移的多步骤过程中,许多信号分子被激活并发生相互作用,形成复杂的信号网络。研究和破解控制肿瘤转移的信号网络和关键调节机制,阻止肿瘤转移,是提高肿瘤治疗效果的根本所在,也是当前国内外肿瘤学家企图攻克的最主要的堡垒。细胞迁移是肿瘤细胞转移的重要基础,细胞骨架的重组是细胞发生迁移的必要条件,因此,调节细胞骨架重组的分子可能在肿瘤细胞转移中发挥重要作用。JWA是新近发现的微管和微丝结合蛋白,可调节两种细胞骨架的重组。本课题组研究证明,JWA表达缺陷可以阻断As2O3对HeLa细胞迁移的抑制,但是可以加强PMA（佛波酯）对细胞迁移的作用。进一步研究发现JWA对细胞迁移的调节作用是通过激活MAPK信号通路不同下游分子以及对微丝重组的作用而实现的。本研究发现,JWA在黑色素瘤转移过程中起到非常重要的作用。我们的结果证明JWA敲减（knock down）可以增加黑色素瘤细胞的迁移、粘附和侵袭能力;体内实验证实在小鼠黑色素瘤B16-F10细胞和人黑色素瘤A375细胞中敲减JWA后显著促进转移瘤的形成和生长;此外,在黑色素瘤病人的肿瘤组织中,JWA在恶性黑色素瘤的表达水平显著低于良性痣。最后,我们的研究证实JWA的上述作用是通过整合素信号通路来实现的,当干涉转录因子Sp1后,就破坏了JWA对整合素分子integrinα_Vβ₃及其下游分子的调节作用,从而逆转JWA对肿瘤转移过程的影响。这些发现表明JWA是抑制黑色素瘤转移的重要靶分子。目标:探讨JWA在调节黑色素瘤转移过程多个环节中的作用及其分子机制。方法:本研究使用有转移性的小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10和人黑色素瘤细胞株A375来进行体内外研究。通过稳定筛选得到JWA低表达的细胞株（B16-As和A375-As）和载体对照的细胞株（B16-Vec和A375-Vec）。首先,我们使用小鼠尾静脉肿瘤转移实验来检验JWA在黑色素瘤体内转移中的作用。接着我们通过划痕实验、Transwell迁移实验和免疫荧光等来研究JWA表达对肿瘤细胞转移过程多个环节的影响及其机制。用粘附实验、侵袭实验和明胶酶谱实验检测JWA是否调节细胞的粘附和侵袭能力。用免疫印迹和RNA干涉等技术探讨了JWA调节肿瘤转移过程的信号通路分子变化规律。最后,我们收集了13例良性痣、5例恶变痣和13例恶性黑色素瘤,用免疫组化方法检测JWA、integrinαV和β3在组织中的表达,初步验证这些分子的表达水平与人黑色素瘤恶性程度的关系。结果:1.在体内模型中,将JWA表达敲减的B16-F10细胞和载体对照细胞通过尾静脉注入小鼠21天后,发现JWA表达缺陷组动物肺转移灶形成数显著高于载体对照组;将JWA表达缺陷和载体对照的人黑色素瘤细胞株A375-As和A375-Vec两组细胞注射入免疫缺陷小鼠的尾静脉中,30天后发现在JWA表达缺陷组中40%的小鼠颈部淋巴结有明显的转移瘤,但在载体对照组未发现明显的颈部转移瘤。通过细胞增殖实验检测了几组细胞的增殖能力,结果发现JWA表达缺陷组和载体对照组的细胞增长速度基本相同。提示JWA缺陷组肿瘤转移灶的增加可能不是由于转染了pEGFP-C1-As JWA质粒造成的细胞增殖能力的增加,而是由于JWA低表达增强了肿瘤转移能力所致。2.通过划痕实验和Transwell迁移实验,发现JWA表达缺陷的细胞与载体对照的细胞相比迁移能力显著增强。免疫荧光的结果显示JWA表达缺陷组细胞周围的肌动蛋白丝明显多于载体对照组,细胞表现出一种更强的移动能力。3.粘附实验发现在纤维粘连蛋白和玻璃粘连蛋白包被的板子上,B16-As细胞粘附能力分别升高了103%和69%,A375细胞粘附能力分别提高了75%和58%。4.细胞侵袭能力试验发现在JWA表达缺陷B16-As和A375-sh细胞中,通过侵袭作用穿过Matrigel包被的Boyden小室的细胞数目分别增加了173%和79%。明胶酶谱法检测黑色素瘤细胞中基质金属蛋白酶的活性的结果显示,B16-As和B16-Vec组细胞的MMP-9活性水平并没有明显改变,但是在B16-As组细胞中MMP-2的活性比载体对照上升了4.5倍。5.在机制研究中发现当干涉JWA表达后,integrinαVβ3信号通路被激活。进一步研究发现,在JWA表达缺陷的B16和A375细胞中通过siRNA和LM609阻断integrinαVβ3信号通路可以降低JWA调节的细胞粘附和侵袭能力。在探讨JWA如何调节integrinαVβ3信号通路时发现,尽管integrinαVβ3启动子区存在很多转录因子的结合位点,但我们分别干涉后却发现只有将B16-As和A375-sh细胞中的Sp1核转录因子干涉后,才能削弱JWA对integrinαVβ3信号通路的调节作用。随着integrinαVβ3蛋白表达水平的降低,肿瘤细胞粘附和侵袭的能力也显著下降。6.用免疫组织化学方法检测了良性痣、恶变痣和黑色素瘤组织中JWA、integrinαV和β3的表达水平。结果发现,在良性痣中JWA的表达水平较高,而在恶变痣和黑色素瘤中JWA的表达却非常低。而integrinαV和β3在恶变痣和黑色素瘤中的的表达水平则正好与此相反,即JWA的染色强度与integrinαV和β3的染色强度存在一种非常显著的负相关关系。结论:总而言之,在本研究中,我们发现黑色素瘤细胞在干涉JWA以后,肿瘤细胞的迁移、粘附、侵袭和体内的转移能力都显著增强。这可能是由于JWA通过转录因子Sp1来调节integrinαVβ3信号通路,从而增加肿瘤细胞的转移潜能。我们的工作对以后研究integrinαVβ3信号通路在肿瘤转移中的作用提供了重要的线索。同时,JWA也有可能成为抗肿瘤转移的靶点或观察肿瘤患者预后和转移的生物标志物。