论文部分内容阅读
耐碱性纤维素酶是一类在碱性环境下具有很高酶活性的纤维素酶,其在洗涤、纺织、饲料、印刷等领域有广泛应用。本论文以Cellulomonas bogoriensis为实验菌株,对其产酶条件进行优化,利用克隆表达获得两种内切型纤维素酶Cel619和Cel800,并对二者的酶学性质进行研究。利用单因素实验确定了实验菌株Cellulomonas bogoriensis产纤维素酶的最佳条件:培养时间3 d、培养基初始pH值10.5、培养温度30℃、碳源2.5%（w/v）玉米秸秆、氮源2.0%（w/v）混合的酵母浸粉和牛肉膏（1:1）、装液量100 mL/500 mL、接种量为4.0%（v/v）。对其粗酶性质进行初步研究,得到最适反应pH值为7.0,具有广泛的pH稳定性;最适反应温度为50℃,在40℃范围内有很好的温度稳定性。在NCBI中查找得到菌株Cellulomonas bogoriensis的全基因组DNA,其中有2种内切型葡聚糖酶,根据其基因序列设计引物,进行克隆与表达。对重组蛋白Cel619诱导表达,确定最佳诱导条件是:诱导温度16℃,IPTG浓度0.8mM。亲和层析得到Cel619和Cel800纯酶组分,分子量大小分别为66.5 kDa和88 kDa,酶的比活力分别是78.25 U/mg和145.3 U/mg。重组酶Cel619和Cel800的最适反应pH值分别为5.0和7.0,pH值为10.0时酶的剩余活性皆达到40%以上,说明该重组酶为耐碱性纤维素酶;在pH5.0-11.0范围内,纤维素酶的剩余酶活力均在70%以上,表明该纤维素酶具有良好的pH值稳定性。最适反应温度分别为70℃和60℃,酶的温度稳定性良好,说明二者可能是耐高温酶。Cel619和Cel800对于某些金属离子和化学试剂表现出良好的耐受性,适当浓度的Na+/K+盐离子对二者酶活均有促进作用,且具有很好的耐盐性。Cel619对可溶性底物CMC的酶活最高,对于不溶性底物微晶纤维素也有一定的活性。Cel619的Km=11.33 mg/mL,Vmax=166.67μmol/min/mg。Cel800具有广泛的底物特异性,对可溶性底物CMC、木聚糖以及海带多糖均有很好的降解活性,其中对CMC的酶活最高,对于不溶性底物微晶纤维素和滤纸也有一定的降解活性。Cel800的Km=9.5 mg/mL,Vmax=304.87μmol/min/mg。重组酶Cel619和Cel800具有耐高温、耐盐碱性以及对金属离子和有机试剂良好的耐受性,因此其在纺织业、洗涤业及环境保护等方面具有广阔的应用前景。