20世纪90年代以来，环境内分泌干扰物(EEDs)或内分泌干扰化学物(EDCs)对人类健康和生态环境的影响引起了学术界和公众的极大关注，也引起了许多国家的高度重视。农药是EEDs中的一大类，其中敌百虫是常用的一种有机磷杀虫剂，已被德国联邦环境机构列为EEDs。近年来，敌百虫的使用量呈持续上升趋势，并且，许多研究结果表明敌百虫对人类和动物的生殖系统均有损害作用，故从生殖内分泌角度探讨其毒性作用机制具有重要的现实意义。本研究利用体外细胞培养模型，侧重于研究敌百虫对卵巢和睾丸类固醇激素合成的影响，并探讨了cAMP信号转导通路在敌百虫暴露导致的类固醇激素合成变化中的作用。第一部分敌百虫对卵巢类固醇激素合成的影响及机制目的观察敌百虫对卵巢类固醇激素合成的影响及机制。方法1．采用体外原代培养的人颗粒黄体细胞(hGLCs)作为染毒模型。2．MTT法测定敌百虫对hGLCs细胞活力的影响，确定染毒剂量。3．不同浓度敌百虫染毒hGLCs 24h，在部分培养液中加入卵泡刺激素(FSH)200ng／ml，8-bromo-cAMP 1mmol／L以及水溶性胆固醇(22R-HC)25μmol／L，用放射免疫法(RIA)检测培养上清中的孕酮水平。4．细胞内cAMP采用无水乙醇法进行抽提，RIA检测cAMP水平。5．real-time RT-PCR测定类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)mRNA表达水平。结果1．根据MTT结果确定敌百虫染毒剂量为：对照组(0μmol／L)、1、5、25和125μmol／L。2．在基础状态下，敌百虫以剂量-依赖和时间-依赖关系抑制孕酮的合成。3．在培养液中加入了200ng／ml FSH之后，敌百虫对孕酮的抑制趋势和在基础状态下一致，在25和125μmol／L组，孕酮下降了44.4％和51.3％；而加入了8-bromo-cAMP之后，敌百虫对孕酮的抑制作用并没有得到缓解。4．不论在基础状态还是在FSH刺激下，敌百虫对hGLCs内cAMP含量没有明显影响。5．培养液中22R-HC的加入抵消了敌百虫对孕酮合成的抑制效应。6．无论在基础状态还是在FSH刺激下，敌百虫均能降低StAR mRNA的表达水平。在125μmol／L组，与对照组相比，StARmRNA降低了近85％。结论敌百虫显著抑制hGLCs类固醇激素的合成，其机制可能涉及到了对胆固醇跨线粒体膜转运的抑制，即抑制了StAR的表达，未涉及cAMP-依赖的蛋白激酶信号转导通路。第二部分敌百虫对睾丸类固醇激素合成的影响及机制目的观察敌百虫对睾丸类固醇激素合成的影响及机制。方法1．MTT法测定敌百虫对小鼠间质细胞瘤细胞(MLTC-1)活力的影响，确定染毒剂量。2．不同浓度敌百虫染毒MLTC-1细胞24h，培养液中加入hCG(0.1U／L)、CT(30ng／ml)、forskolin (10μmol／L)、22R-HC(25μmol／L)或孕烯醇酮(10μmol／L)继续染毒4h，RIA法检测细胞培养上清中的孕酮和cAMP水平。3．real-time RT-PCR测定StAR、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)mRNA表达水平的变化。4．蛋白印迹法(western blot)测定StAR、P450scc蛋白表达水平的变化。结果1．根据MTT结果确定敌百虫染毒剂量为：对照组(0μmol／L)、0.04、0.2、1、5、25μmol／L。2．在hCG、CT或forskolin刺激下，敌百虫均显著抑制孕酮的合成。在25μmol／L组，孕酮下降了近85％。3．在hCG、CT或forskolin刺激下，敌百虫对MLTC-1细胞内cAMP水平没有明显影响。4．敌百虫染毒MLTC-1细胞24h后，StAR mRNA和StAR蛋白水平均呈剂量-依赖下降，但敌百虫对StAR蛋白的抑制作用比StAR mRNA的抑制作用更为明显。5．在培养液中加入了22R-HC时，敌百虫仍抑制孕酮的合成；而加入了孕烯醇酮之后，敌百虫对孕酮的抑制作用消失了。6．敌百虫染毒MLTC-1细胞24h后，P450scc mRNA和P450scc蛋白水平均呈剂量-依赖下降，并且下降趋势一致。结论敌百虫显著抑制MLTC-1细胞类固醇激素的合成，其机制可能涉及敌百虫抑制胆固醇的跨线粒体膜转运及P450scc的活性，未涉及cAMP-依赖的蛋白激酶信号转导通路。