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凤丹(Paeonia ostii)属于芍药科芍药属的多年生木本植物,具有很高观赏价值、药用价值和油用价值。凤丹作为卫生部批准的油用牡丹资源,因其易成活、结籽量大、不饱和脂肪酸含量高等优点而在全国二十多个省区推广种植,尤其是山区和沙荒地等干旱或半干旱地区。在干旱或半干旱生境条件下,干旱胁迫是影响凤丹生长的主要非生物胁迫因子,如何缓解干旱胁迫对凤丹的伤害已成为目前亟待解决的问题。而系统研究干旱胁迫对凤丹的影响、采取适宜的措施缓解干旱胁迫对凤丹的伤害并找到凤丹响应干旱胁迫的关键基因,对于改善凤丹在干旱或半干旱地区的生长状况具有十分重要的理论和实践意义。为此,本研究以凤丹为材料,分析了凤丹对干旱胁迫的生理响应,探讨了外源氯化钙(CaCl2)对凤丹干旱胁迫伤害的缓解作用,基于转录组测序筛选了凤丹响应干旱胁迫的关键基因,克隆了候选基因PoCCoAOMT序列并对其调控耐旱功能进行了验证,主要结果如下:(1)干旱胁迫引起了凤丹叶片萎蔫、干枯,降低了叶片相对含水量,增加了胁迫相关生理指标中的相对电导率(REC)、丙二醛(MDA)含量、过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2·-)积累量,提高了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化酶活性。同时,干旱胁迫使得凤丹净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)、最大光能利用效率(Fv/Fm)、实际光合效率(Y(Ⅱ))下降,而使得非光化学叶绿素荧光猝灭系数(qN)、调节性能量耗散的量子产量(NPQ)上升。此外,持续干旱胁迫会破坏凤丹叶片的叶绿体结构、关闭叶片气孔,进而抑制植物进行光合作用。(2)外源CaCl2处理能够减轻干旱胁迫下凤丹叶片的萎蔫、干枯等症状,降低叶片相对含水量的下降速度,使植株一直保持较低的脯氨酸(Pro)含量、REC、H2O2和O2·-积累量以及较高的SOD、POD、APX等抗氧化酶活性。此外,外源CaCl2处理能够增加光合与叶绿素荧光参数中的Pn、Gs、Ci、Tr Fv/Fm、Y(Ⅱ)和qN,降低最小荧光(Fo)。(3)对自然干旱处理后第12天的凤丹叶片和对照进行了转录组测序,共获得了78,391个高质量的unigenes,其中33,877个unigenes得到注释。在此基础之上,共鉴定到22,870个差异表达基因(DEGs),采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对随机选择的18个DEGs表达模式进行检测,验证了 RNA-seq数据准确、可靠。DEGs的Pathway功能分析显示,共有6,997个DEGs定位于126个通路中,但只有23个通路满足Q≤0.05,其中有7个通路上调,有16个通路下调。这些通路可以被归纳为6大类:ROS系统、次生代谢的生物合成、光合代谢、脯氨酸代谢、脂肪酸代谢和植物激素代谢。其中,大量与ROS清除、光合作用和玉米素合成通路相关的DEGs下调,与脯氨酸合成和亚麻酸合成通路相关的DEGs上调。(4)采用RACE技术对前期筛选获得的凤丹响应干旱胁迫的候选基因进行克隆,并获得了PoCCoAOMT基因全长序列,该序列长987 bp,开放阅读框为744 bp,共编码247个氨基酸,与其他植物的CCoAOMT序列均有较高的同源性。对PoCCoAOMT基因编码的氨基酸序列进行生物学信息分析发现,该蛋白分子量为27915.84 Da,属于稳定蛋白和亲水性蛋白,不存在信号肽,且蛋白位于膜外。采用qRT-PCR技术检测了PoCCoAOMT基因在干旱胁迫处理凤丹叶片与对照中的表达水平,结果显示干旱胁迫诱导了PoCCoAOMT基因的表达。(5)构建含PoCCoAOMT基因序列的超表达载体pCAMBIAD01-PoCCoAOMT,借助烟草进行亚细胞定位观察发现其主要定位于细胞质中,并在叶绿体中也有少量表达。通过农杆菌介导法将载体转入烟草并经PCR和qRT-PCR检测得到阳性转基因植株。对野生型和转基因烟草进行自然干旱处理,在干旱胁迫23天后野生型烟草叶片严重萎蔫下垂,而转基因烟草一直保持正常生长状态。(6)在干旱胁迫下,转基因烟草一直保持较低的REC、H2O2和O2·-积累量,较高的叶片相对含水量、SOD和POD活性以及Pn、Gs、Ci、Tr、Fv/Fm和Y(Ⅱ)等光合与叶绿素荧光参数,并且过敏诱导蛋白18基因(HIN1)、半胱氨酸蛋白酶1基因(CP1)和半胱氨酸蛋白酶2基因(CP2)等与衰老相关的基因在转基因烟草中的表达水平同样较低。此外,转基因烟草的根、茎、叶等组织中PoCCoAOMT基因表达水平和木质素含量在干旱胁迫下均较野生型高,并且在根中最高,叶片中最低,同时干旱胁迫还诱导了转基因烟草叶片中苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)、肉桂醇脱氢酶基因(CAD)、4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)和咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)等与木质素合成相关的基因高量表达,上述结果表明凤丹PoCCoAOMT基因可以通过促进木质素大量合成来提高植株对干旱胁迫的抗性。