目的:Sirtuin 5（SIRT5）是NAD+依赖的III类蛋白质去乙酰基酶,其在前列腺癌中的作用尚未报道。因此,我们研究了SIRT5对前列腺癌的作用,以探索SIRT5在前列腺癌的诊断和治疗的新方法。首先进行了免疫组织化学实验,了解57例前列腺癌组织中SIRT5的表达情况。我们发现,Gleason评分>7的患者组织中SIRT5的表达水平与Gleason评分≤7的患者的组织表达水平显著不同（P<0.05,R>0）。此外,通过通路筛选相关实验表明,SIRT5调节了有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的活性,进而调节了MMP9和细胞周期蛋白Cyclin D1的表达。在质谱分析中,我们找到了可以与SIRT5发生相互作用的蛋白,乙酰辅酶A乙酰转移酶1（ACAT1）蛋白。作为SIRT5的底物,ACAT1受SIRT5调控,并且SIRT5通过ACAT1调节MAPK通路的活性。这些结果表明,SIRT5通过ACAT1促进了MAPK通路的活性,促进了前列腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力。总而言之,以上结果表明SIRT5表达与前列腺癌的进展密切相关。了解潜在的机制可能为疾病的诊断和治疗提供新的目标和方法。研究方法:1.本研究中检查的前列腺癌标本共57例,均来自中国医科大学附属第一医院,年限从2013年至2017年,并得到病理科两位老师的诊断,进行严格的Gleason评分。该研究得到中国医科大学伦理委员会的批准,并获得所有患者的知情同意。2.本研究所使用的细胞系（LNCa P和PC-3）均从上海细胞库（中国上海）获得,并使用不含抗生素的10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中培养。将LNCa P和PC-3细胞在37℃,5%CO2恒温箱中培养。3.质粒构建和转染的实验中,我们采用SIRT5 si RNA,ACAT1 si RNA,及其对照si NC;Flag-SIRT5质粒,其对照是Flag-p CMV6以及ACAT1的过表达质粒ACAT1-3Flag及其对照GV141。使用Lipofectamine 3000试剂转染细胞,72小时后用免疫蛋白印记实验检测转染效率。4.免疫组织化学采用链霉素生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）进行免疫组化。将组织切片与SIRT5兔多克隆抗体一起在4℃孵育过夜。在37℃下添加二抗30分钟。用苏木精将细胞核染色10分钟,并在显微镜下观察SIRT5蛋白的表达。χ2检验用于确定SIRT5表达与临床病理特征之间的相关性。P<0.05被认为具有统计学上的显著差异。5.蛋白质印迹实验首先使用裂解缓冲液用于提取细胞的总蛋白。然后,我们添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物,裂解液的体积为细胞沉淀体积的四倍。通过SDS-PAGE分离蛋白质（35μg）,并转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。将膜用5%脱脂牛奶封闭至少2 h,然后在4℃下与适当的一抗孵育过夜。然后将其与过氧化物酶偶联的二抗在37℃下孵育1小时。使用增强的化学发光法可视化蛋白质。使用Image J软件定量评估每个条带得到其灰度值,并使用Prism 5.0软件对灰度值进行比较。6.实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）使用SYBR Green PCR Master Mix在7900HT快速实时PCR系统中以20微升的总体积进行q RT-PCR实验。离解步骤用于产生解链曲线并确认扩增特异性。使用2-ΔΔCt方法计算相对于β-肌动蛋白的基因表达。7.MTS增殖测定是将SIRT5表达上调或下调的细胞接种到96孔板中（3000个细胞/孔）。每种处理因素设置5个副孔,并在10%FBS中培养。加入20微升3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑盐（MTS）溶液以检测细胞活力。在黑暗中于37℃孵育1小时后,使用酶标仪在490 nm波长处测量每个板的颜色强度。根据该方法制备了五个相似的细胞的96孔培养板,每天选择一个板进行MTS测试。8.集落形成试验是将处理因素处理过的细胞以每孔800个细胞的密度接种到6孔培养板中,并在细胞培养箱中培养10-14天,当菌落大致长至2mm收集六孔板。将每个孔的细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤3次,用预冷的甲醇固定10分钟,再用PBS洗涤3次,最后用结晶紫染色10分钟,并放置自来水中30分钟。捞出干燥后,手动计数菌落。9.Transwell实验分析是将过表达或者低表达的SIRT5蛋白以及其他处理因素处理过的前列腺癌细胞（每100μL中有105个细胞）接种到Transwell小室,放置在24孔板中,培养基中血清浓度为20%。在24小时后,收transwell小室,以观察其迁移能力。穿过膜的细胞用结晶紫染色,干燥并手动计数。10.免疫荧光是将适当数量的细胞接种在共聚焦的培养皿中,在含有10%FBS中培养,用4%多聚甲醛固定15分钟,然后用0.1%Triton X-100处理10分后用3%的牛血清白蛋白封闭至少2小时。接下来,将细胞与SIRT5一抗或ACAT1一抗在4℃下孵育过夜。第二天除去一抗后,用PBS洗涤3次,并与二抗在37℃黑暗中孵育2小时。用于线粒体的Mito SOX红色线粒体超氧化物指示剂标记线粒体。细胞核用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色10分钟。最后,使用共聚焦显微镜获得随机细胞图像。11.免疫共沉淀（Co-IP）分析是将所需的细胞系接种在两个10厘米细胞培养皿中。细胞长满后,将其裂解并在4℃下以12000 rpm离心15分钟。接下来,将60μL琼脂糖A/G珠子添加到上清液中,并旋转震荡至少2 h。然后将混合物在4℃1000rpm下离心5分钟。将上清液分为两部分,在一部分中加入目标抗体（每毫克蛋白加2微克抗体）,在另一部分中加入抗小鼠/兔Ig G。将混合物在旋转振荡器中,4℃摇动过夜。第二天,将25μL琼脂糖A/G磁珠添加到每个试管中,并在4℃下孵育6小时。接下来,洗涤细胞裂解物,后加入2X Loading Buffer,在沸水中加热10分钟,后进行免疫印迹分析。12.活性氧检测法使用探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）,测定前列腺癌细胞中的活性氧（ROS）水平,其与细胞内氧气结合形成高荧光化合物二氯荧光黄（dichlorofluorescein）。用SIRT5质粒或si RNA转染48小时后,将细胞与10μM DCFH-DA一起在37℃,5%二氧化碳的细胞培养箱中黑暗培养20分钟。用冷PBS洗涤细胞3次以去除过量的荧光探针,计数,并添加至96孔板（104细胞/孔）。在488nm处测量吸光度。13.对于抑制剂的使用,采用以下药物处理细胞:SIRT5 inhibitor 1,SIRT5的特异性抑制剂,浓度为0.1μM,处理6 h;K-604 dihydrochloride,一种有效的ACAT1的特异性抑制剂,浓度为0.4μM,持续处理6 h;MG-132,蛋白酶体抑制剂,可以有效防止26S蛋白酶体水解,其浓度为18.5μM,持续处理24小时。14.本研究使用了以下数据库:cBio Portal（www.cbioportal.org）,Oncomine（www.oncomine.org）和the Human Protein Atlas（www.proteinatlas.org）数据库。cBio Portal数据库用于分析前列腺癌中的SIRT5突变,并确定这些突变是否有意义。使用Oncomine和人类蛋白质图谱数据库来分析SIRT5在肿瘤细胞中的表达。15.所有数据均使用SPSS 24.0版（中国北京）进行χ2测试进行统计分析,或使用Prism 5（Graph Pad,美国加利福尼亚州拉荷亚）进行分析。在相同条件下,所有实验至少重复独立地进行三次。P值<0.05被认为具有统计学意义。结果:1.为了研究SIRT5在人前列腺癌组织中的表达,我们对57个随机选择的前列腺组织切片进行了免疫组织化学实验。正常前列腺组织中SIRT5不表达,而在肿瘤组织中的表达高。根据Gleason评分标准对57个组织切片进行评分。在Gleason评分等于7时,前列腺癌组织有两组:（3+4）和（4+3）组。两组之间的差异无统计学意义（P=0.797）。同样,在Gleason评分为6和7的组织中,SIRT5的表达也没有显著差异（P=0.396）。此外,评分为8和9两组的表达差异也无统计学意义（P=0.262）,因此将评分为8和9的归为一组。并且,将评分8和9合并为一组时,SIRT5蛋白表达与评分为7（P=0.028）和评分为6（P=0.001）的组显著不同。因此,我们得出结论,SIRT5表达与前列腺癌Gleason评分有关。在cBio Portal数据库中,我们发现SIRT5基因在前列腺癌中发生了突变,并且大多数的突变为深度缺失突变和错义突变。这些突变可能与前列腺癌患者的预后有关。但是,在我们的目前已知的数据中没有明显的统计学意义。因此,我们忽略了SIRT5基因突变对前列腺癌的影响。人类蛋白质图谱数据库中确定了SIRT5表达增加的62种不同肿瘤细胞系。在PC-3细胞（一种具有代表性的前列腺癌细胞系）中,这种增加与其他肿瘤细胞系相比,增加较明显。与其他肿瘤细胞系相比,在Shankavaram Cell Line（Oncomine）数据库中,PC3细胞中SIRT5表达的也较高。2.基于以上发现,我们接下来研究了SIRT5在前列腺癌中的作用。选择LNCa P和PC-3细胞系进行这些研究。进行细胞增殖实验和菌落形成实验以评估SIRT5表达对前列腺癌细胞增殖能力的影响。在两种细胞系中的测定结果一致,即上调SIRT5表达可促进细胞生长,当SIRT5表达下降后,细胞的增殖能力减弱。表明SIRT5可以促进前列腺癌细胞的生长。在Transwell迁移实验中,SIRT5蛋白在LNCa P细胞中过表达后,细胞迁移能力得以增强。另外,在下调SIRT5蛋白表达后,LNCa P细胞迁移能力降低。在PC-3细胞中获得了相似的结果。此外,SIRT5降低了ROS的水平。这些结果表明SIRT5在前列腺癌细胞中起到促进肿瘤的作用。3.为了了解SIRT5蛋白如何影响前列腺癌细胞,我们进行了蛋白质印迹分析。SIRT5蛋白下调导致细胞周期蛋白D1蛋白（与细胞周期有关）和MMP9蛋白（与迁移和侵袭有关）显著降低。另外,MAPK信号通路的相关蛋白的活性被显著抑制。当SIRT5过表达时,MAPK信号通路蛋白的活性和下游功能蛋白的水平增加。这些变化与体外增殖和迁移实验的结果相呼应,并证明了SIRT5蛋白参与调节前列腺癌中的MAPK信号通路以发挥促肿瘤作用。为了明确是否是SIRT5改变而发挥的作用,我们添加了SIRT5的特异性抑制剂,发现MAPK信号通路受到抑制,相关功能蛋白的表达水平明显降低。在si-SIRT5处理的细胞中增加SIRT5的表达后,相关蛋白的表达也增加了。4.为了研究SIRT5如何影响MAPK信号通路,是否直接影响MAPK信号通路?我们进行了质谱分析。结果表明,ACAT1可以与SIRT5发生相互作用。为了进一步研究此发现并确定SIRT5是否在基因或蛋白质水平上调节ACAT1,接下来进行了q RT-PCR实验以及Western实验。无论LNCa P细胞中转染或者干扰SIRT5,ACAT1m RNA的水平均未改变,在PC-3细胞中也得到了相同的结果,表明SIRT5不调节ACAT1 m RNA水平。基于这些发现,我们将重点转移到蛋白水平的调控上,发现在干扰LNCa P细胞中SIRT5的表达后,ACAT1的蛋白水平降低,而SIRT5的表达增加后ACAT1的蛋白水平升高。相反,在改变ACAT1表达后,SIRT5蛋白水平没有改变。在PC-3细胞中也获得了相同的结果。这些结果表明SIRT5可以在蛋白水平上调节ACAT1的表达,但ACAT1不能调节SIRT5的表达。在SIRT5的表达降低并添加了MG-132之后,ACAT1蛋白的表达没有显著增加,说明SIRT5并不通过蛋白酶体途径调节ACAT1。在LNCa P和PC-3细胞中进行的Co-IP实验表明,SIRT5和ACAT1在体外相互结合。通过共聚焦实验证实了结果,该实验揭示了蛋白质SIRT5和ACAT1共定位在细胞的线粒体中。5.鉴于以上结果,我们了解了SIRT5蛋白对前列腺癌细胞的作用。在SIRT5正常表达下,沉默ACAT1蛋白也可以抑制LNCa P和PC-3细胞中的MAPK信号通路。接下来,我们探索了LNCa P和PC-3细胞中这些蛋白质与MAPK信号通路之间的关系。与对照组和仅用flag-SIRT5转染的细胞相比,通过si RNA-ACAT1和flag-SIRT5的共转染降低了MAPK信号通路的活性,从而降低了下游功能蛋白Cyclin D1和MMP9的表达。在添加ACAT1蛋白的特异性抑制剂后,这种抑制现象更为明显。干扰ACAT1后还抑制了SIRT5在MTS、集落形成和Transwell迁移实验中的功能。此外,当SIRT5蛋白的表达降低时,转染ACAT1恢复了相关蛋白的表达。总体而言,这些结果表明SIRT5通过ACAT1调节MAPK信号通路,并在前列腺癌中具有促进肿瘤的作用。结论:1.SIRT5在前列腺癌细胞中的高表达与肿瘤Gleason评分相关。2.SIRT5促进细胞增殖和迁移。3.SIRT5调节MAPK信号通路。4.SIRT5与ACAT1结合并调节其表达。5.SIRT5通过ACAT1调节前列腺癌细胞的功能。