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第一部分、骨矿化前体的形成机制研究目的:明确天然骨矿化发生过程,探究骨矿化前体的来源,并探讨其形成机制。材料和方法:收集处于发育不同时间点的C57B16小鼠胚胎,制作石蜡切片,对组织切片行碱性磷酸酶（ALP）染色以明确顶骨发生时间;自顶骨发生时间点开始,每隔0.5天收集胚胎顶骨,采用透射电镜、扫描电镜等观察分析胞外胶原矿化过程,成骨细胞超微结构及矿化前体形成转运等;采用X射线能谱（EDS）元素分析检测矿化前体无机离子聚集情况;选区电子衍射（SAED）分析检测矿化前体及胶原的结晶状态;收集胚胎第18.0天中切牙牙胚,采用透射电镜观察牙本质矿化;提取小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,体外诱导BMSCs及小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）向成骨细胞分化,采用透射电镜、扫描电镜等观察分析体外胶原矿化过程,细胞超微结构等;对成骨细胞行线粒体荧光探针和钙黄绿素染色,激光共聚焦显微镜下检测线粒体外膜通透性改变;采用离子霉素提高成骨细胞内游离钙水平,透射电镜观察离子霉素作用下成骨细胞超微结构变化;采用聚乳酸—羟基乙酸共聚物（PLGA）包裹黑磷纳米片,细胞内吞纳米颗粒使胞内磷离子浓度升高,透射电镜观察黑磷纳米颗粒作用下成骨细胞超微结构变化;采用毒胡萝卜素（TG）特异性阻断内质网钙泵活性,明确内质网在矿化前体发生中的作用;茜素红染色检测成骨细胞矿化水平。结果:C57B16小鼠胚胎发育至第14.0天,顶骨区域ALP染色阳性,并且此时细胞外出现胶原原纤维,但未见矿化发生;胚胎第14.5天,胞外间质可见矿化前体,矿化前体主要分布于胶原周围并引发纤维内矿化;胚胎第15.0天,矿化胶原呈现明显的周期性横纹;胚胎第15.5天,胞外间质出现较大尺寸的矿化前体;至胚胎第18.0天,胶原纤维内矿化基本完成,并可见纤维间矿化;牙本质胶原矿化与顶骨相似;顶骨区域成骨细胞内线粒体结构变化明显,最初可见无机颗粒沉积于线粒体内部,继而线粒体形态逐渐改变并最终经溶酶体途径降解,同时释放矿化前体;成骨细胞线粒体内局部无机离子沉积常见于靠近内质网的一侧,有时可见内质网膜上存在钙磷团簇;体外成骨细胞矿化超微观察结果与体内一致;激光共聚焦检测发现成骨细胞部分线粒体可被钙黄绿素染色,表明线粒体外膜通透性改变;提高成骨细胞胞内游离钙和磷离子的浓度,可促进内质网上钙磷团簇的形成以及成骨细胞的矿化,TG可有效阻断内质网上钙磷团簇的形成并抑制矿化结节的产生。结论:骨矿化是由成骨细胞产生的矿化前体所引发;骨矿化前体来源于成骨细胞线粒体内的无机离子沉积颗粒;线粒体内无机颗粒的形成与内质网有关,内质网富集钙和磷离子从而在内质网膜上形成钙磷团簇,继而这些钙磷团簇被转运至线粒体内形成线粒体内沉积颗粒;内质网钙摄取在矿化前体形成过程中发挥至关重要的作用,抑制内质网钙泵的功能,内质网膜上钙磷团簇的形成受阻。第二部分、成骨细胞来源胞外囊泡的促成骨作用研究目的:对比处于不同分化阶段成骨细胞产生的胞外囊泡（含矿化前体）的促成骨效果,并探讨影响其促成骨能力的可能因素。材料和方法:体外诱导MC3T3-E1细胞成骨向分化,连续收集细胞培养液,并采用差速离心法,按照外泌体/矿化前体提取步骤提取细胞培养液中MC3T3-E1所分泌的胞外囊泡;透射电镜下观察囊泡形态,Western blot检测外泌体标记蛋白CD63及和高尔基体标记蛋白GM130;通过荧光定量聚合酶链式反应（PCR）和茜素红染色技术,分析MC3T3-E1所分泌的胞外囊泡对BMSCs成骨分化能力的影响;对胞外囊泡进行超微观察、粒径测定以及ALP活性相对定量,总结MC3T3-E1细胞矿化不同时间点所产生的胞外囊泡的变化规律,将成骨细胞分化过程划分成不同阶段;建立小鼠卵巢切除（OVX）骨质疏松模型,OVX手术后4周,采用尾静脉注射方法,将胞外囊泡以3 mg/kg的量注入小鼠体内,每周一次、连续4周;行胞外囊泡注射4周后,采用Micro-CT对小鼠股骨进行三维重建并对骨小梁指标BV/TV,Tb.N,Tb.Th和Tb.Sp进行分析;制作小鼠股骨石蜡切片,行HE染色,观察骨小梁等骨量情况;采用体外矿化诱导液（SCL）孵育MC3T3-E1所分泌的胞外囊泡,使矿化前体内无机离子含量升高,检测矿化前体成熟度对其促成骨能力的影响;检测成骨分化各阶段MC3T3-E1所分泌的胞外囊泡对BMSCs成骨相关基因表达的影响;荧光标记胞外囊泡,应用小动物活体成像技术,检测成骨分化各阶段MC3T3-E1所分泌的胞外囊泡的骨靶向性。结果:Western blot分析结果显示,成骨向分化中MC3T3-E1所分泌的胞外囊泡同时具有外泌体和矿化前体的特征,呈CD63阳性并且部分囊泡内部有无机离子聚集;成骨向分化中MC3T3-E1所分泌的胞外囊泡促进BMSCs的成骨向分化,并呈剂量依赖性;随着MC3T3-E1的不断分化,其所分泌的胞外囊泡呈现高电子密度的比例逐渐升高,并且到一定时期后,囊泡粒径明显变小,此外,胞外囊泡的ALP活性也呈规律性变化;依据胞外囊泡粒径及ALP活性,可将MC3T3-E1成骨分化过程划分成早期、中期、中晚期和晚期四个阶段;小鼠股骨Micro-CT分析及HE染色结果显示,MC3T3-E1分化中期及中晚期所分泌的胞外囊泡具有明显的促成骨能力;SCL液孵育使成骨分化中期的胞外囊泡粒径明显变小,并且促成骨能力增强;成骨分化中晚期的胞外囊泡经SCL液孵育后,针状晶体增多、膜泡结构减少,同时其促成骨能力减弱;成骨分化中晚期的胞外囊泡促进BMSCs成骨相关基因的表达,表现出骨诱导能力;成骨分化中期及中晚期的胞外囊泡具有靶向性。结论:MC3T3-E1成骨分化不同阶段产生的胞外囊泡促成骨能力不同,这与囊泡中矿化前体的成熟度有关。同时,胞外囊泡的骨靶向性与骨诱导性,也将可能影响其促成骨能力。