目的:RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种细胞在进化过程中保留的在转录后水平对基因表达进行沉默或抑制的调控方式。RNAi作用广泛存在于真核细胞中。在真核细胞中,RNAi过程主要由小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和微小RNA(microRNA,mi RNA)介导完成。siRNA或miRNA识别并结合Argonaute 2(Ago2)蛋白后形成RNAi的效应器—RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC介导siRNA或miRNA对于靶mRNA的识别及切割,在RNAi过程中发挥了至关重要的作用。因此RISC的核心组分Ago2蛋白被称为RNAi装置的催化引擎。因此对于核心分子Ago2的调控研究有助于深入了解RNAi的作用过程。本实验室前期工作中,通过酵母双杂交系统筛选出了Ago2的相互作用蛋白26S蛋白酶体ATP酶亚基3(PSMC3)和RBBP6。并证实了PSMC3可以通过泛素化-蛋白酶体途径依赖的方式调节Ago2蛋白的稳定性,然而具体的分子机制尚不明确。本课题拟从泛素化角度展开PSMC3和RBBP6蛋白对Ago2蛋白的稳定性调控机制的研究。方法:首先,我们利用溶酶体及蛋白酶体抑制剂处理细胞,检测Ago2蛋白水平及泛素化水平的变化。然后,通过检索BioGRID数据库选定PSMC3可能的相互作用分子USP14为候选研究对象。其后,我们通过免疫共沉淀实验、免疫荧光结合共聚焦显微镜采集图像分析、放线菌酮实验、Western blot及免疫沉淀等实验验证了PSMC3为USP14的相互作用蛋白并且Ago2是USP14的作用底物且USP14可以调控Ago2的泛素化水平。随后,通过构建USP14的不同突变体并结合免疫共沉淀分析确定了USP14与Ago2及PSMC3相互作用的结构域;通过Western blot实验确定了PSMC3对于Ago2的稳定作用依赖于USP14。同时,我们通过免疫共沉淀实验初步验证了RBBP6与Ago2蛋白的相互作用,并通过Western blot实验确定了RBBP6可以促进Ago2蛋白的泛素化并增强Ago2的降解。最后,通过Western blot实验确定了RBBP6,PSMC3及USP14对于RNAi作用的影响。结果:蛋白酶体抑制剂可以促进泛素化的Ago2蛋白在体内的累积。USP14可以分别与PSMC3及Ago2相互作用。干扰USP14可以明显缩短Ago2蛋白的半衰期。USP14特异性抑制剂能够促进泛素化的Ago2在细胞内累积。USP14可以调控Ago2蛋白的水平且MG132使得此调控作用消失。确定了USP14分别与PSMC3及Ago2相互作用的最小结构域。RBBP6与Ago2相互作用。RBBP6可以调控Ago2蛋白的水平且MG132使得此调控作用消失。RBBP6,PSMC3及USP14表达水平的改变可以影响RNAi的干扰效率。结论:本研究揭示了Ago2蛋白泛素化及去泛素化的调控过程。确定了USP14对于Ago2的去泛素化调控并抑制其随后在26S蛋白酶体中的降解,并且证明PSMC3可以促进此调控过程。同时初步确定了RBBP6促进Ago2泛素化的作用。