研究背景恶性肿瘤起病隐匿,微小癌灶的浸润和转移难以早期发现和和诊断,影响及时治疗,这是影响患者生存期的主要原因。因此,阐明肿瘤浸润及转移的机制,确立可靠的实验室预后指标和探索治疗恶性肿瘤靶点对恶性肿瘤患者临床治疗极为重要。研究发现,随着肿瘤进展和转移的发生,肿瘤细胞内抑癌蛋白的表达量减少,逐渐失去对肿瘤细胞生长、转移的抑制,进而导致肿瘤的浸润与转移。而抑癌基因的失活是编码蛋白量减少的重要机制之一。为揭示抑癌基因失活的机理,国内外针对P53、P16等抑癌基因作了大量研究,结果表明基因的遗传不稳定性改变,即微卫星不稳定性（microsatellite instablility,MSI）和杂合性缺失（loss ofheterozygosity,LOH）可能是产生基因突变,导致抑癌基因功能失调,引起肿瘤发生的重要因素。微卫星是由2～6个核苷酸组成,具有高度多态性的简单串联核苷酸重复序列。MSI是指由于复制错误导致微卫星的增多或减少。LOH是指一个位点上两个多态性的等位基因中的一个出现缺失或变异。大量研究表明,抑癌基因MSI与LOH在肿瘤的多步骤发生过程中起着重要的作用。MSI首先是在遗传性非息肉性结直肠癌（heredity non-polyposis colorectal cancer,HNPCC）中发现的,随后在各种散发性肿瘤,如大肠癌、胃癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均发现MSI。研究表明MSI的发生提高了随机突变率,更重要的是导致了肿瘤相关基因的突变,可能是引起肿瘤发生的一个重要机制。若DNA复制错误的结果是等位基因片段的缺失,则导致LOH的发生。研究发现与抑癌基因相关的杂合性微卫星位点常伴有等位基因的丢失,即LOH的发生。所以分析LOH已成为目前检测抑癌基因失活、发现和定位新的肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene,TSG）的重要手段之一。分泌型卷曲相关蛋白1（Secreted Frizzled-related Protein 1,sFRP1）定位于8p12-p11.1,包含3个外显子和2个内含子。sFRP1基因近年来作为一种候选抑癌基因而研究,其编码一种分泌性糖蛋白,是Wnt信号通路的一种上游抑制物。sFRP1蛋白约由313个氨基酸构成,大小约35.3kDa。Wnt/β-catenin信号途径的作用特点是:在缺乏Wnt信号时,胞浆内新合成的β-catenin维持在一个稳定的低水平。β-catenin与胞浆中由多种蛋白包括APC（adenomatous polyposis coli）、GSK-3β（glycogen synthase kinase-3β）、Axin、β-TrCP/Slimb等组成的“降解复合物”结合,Axin和APC提供一个使GSK-3β和β-catenin附着的支架,GSK-3β能够使β-cateninNH₂端的丝/苏氨酸残基磷酸化。被磷酸化了的β-catenin可以被β-TrCP识别并进而被其泛素化,β-catenin以蛋白酶体的方式迅速降解,这样胞浆中游离β-catenin就保持在低水平而不会有过多沉积。当Wnt信号存在时,Wnt蛋白与蛇根碱受体家族的7次跨膜卷曲蛋白（Frz）的胞外区结合,在低密度脂蛋白受体相关蛋白（LDL-receptor-related protein,LRP）协同作用下,存在于细胞浆中的Dishevelled（Dvl或Dsh）蛋白被募集至胞膜下,Dvl能够把GSK-3β磷酸化,致GSK-3β从Axin上脱落,β-catenin不能被降解,大量游离的β-catenin在胞浆中聚集并进而进入细胞核内。在核内无β-catenin时转录因子家族的TCF/LEF通过HMG盒（HMG boxes）与DNA结合,DNA的转录活性被抑制。β-catenin与TCF/LCF结合形成复合体后,TCF/LEF抑制作用被解除,特异地启动、激活下游Wnt靶基因的转录。目前已经证实的靶基因包括c-myc、cyclinD1等。而这些靶基因与细胞凋亡、细胞生长、血管生成及肿瘤侵袭转移相关。sFRP1与Wnt的受体卷曲蛋白（frizzled,Frz）受体的胞外区有相似的核苷酸序列,但是,与Frz受体不同,sFRP1缺乏用来转导Wnt信号的跨膜区和胞内区,因此,sFRP1通过与受体竞争结合Wnt蛋白,或直接与Wnt蛋白结合,由此阻断了Wnt信号传导通路,sFRP1基因的表达沉默,可引起Wnt的持续存在,激活Wnt靶基因,导致恶性肿瘤的发生、恶化。目前发现有十几种已知的高发性癌变源于Wnt信号传导途径的失调。既往研究表明,在结肠癌、肺癌、子宫癌、乳腺癌、食管癌中,sFRP1表达下调与其启动子甲基化有关。Shih.YH等研究指出,91.5%的HCCs相对于癌旁肝组织的sFRP1表达量下调,说明其在HCC中同样发挥抑癌作用,导致其表达沉默的机制之一为启动子甲基化,值得注意的是,在未能检测出启动子甲基化的HCCs病例中,同样存在sFRP1蛋白的下调,说明有其他机制参与其表达沉默,如LOH。有关sFRP1基因的研究,目前多集中于启动子甲基化的研究,而该基因的遗传不稳定性研究少见。研究目的研究sFRP1基因D8S532位点、D8S1722位点微卫星不稳定（microsatelliteinstablility,MSI）和杂合性缺失（loss of heterozygosity,LOH）,对其蛋白表达的影响,阐明sFRP1基因遗传不稳定性与肝癌进展的关系,为揭示抑癌基因作用机制和肿瘤发生发展机制提供实验依据。研究方法（1）苯酚-氯仿抽提法,提取石蜡包埋肝癌组织的基因组DNA。（2）PCR-单链构象多态性（SSCP）、常规银染检测位点的遗传不稳定性。（3）Envision免疫组织化学染色检测蛋白表达。（4）Leica-Qwin计算机图象分析系统摄像并存入计算机,Image-Pro P1uS（IPP）Version4.5专业图像分析软件进行蛋白分析。（5）SPSS软件统计分析相关性。研究结果（1）肝癌sFRP1基因遗传不稳定性及肿瘤临床病理特性的相关性研究:①42例肝癌中D8S532位点的LOH和MSI检出率分别为11.90%（5/42）和9.52%（4/42）。该位点LOH发生率与患者年龄、性别、脉管转移、TNM分期、分化程度、肿瘤大小、AFP、ALT和TB均无明显相关性;MSI发生率在60岁以上年龄组（>=60）,高于60岁以下年龄组组（<60）（23.53%vs 0.00%,P<0.05）,与其他临床病理特征无显著相关性。②42例肝癌中DSS1722位点的LOH检出率为14.29%（6/42）,MSI检出率为9.52%（4/42）（表2）。该位点LOH、MSI与患者年龄、性别、脉管转移、TNM分期、分化程度、肿瘤大小、AFP、ALT和TB均无相关性。（2）肝癌sFRP1蛋白表达与遗传不稳定性的相关性研究:①对照于癌旁肝组织,42例肝癌组织,88.10%（37/42）的sFRP1蛋白有不同程度表达下降;肝癌中sFRP1蛋白阳性检出率为47.62%（20/42）。②肝癌高分化组中sFRP1蛋白阳性率为100.00%,高于中低分化组的23.53%（P<0.05）。③蛋白表达阳性组中D8S532 LOH发生率（0.00%）低于蛋白表达阴性组（22.73%）（P<0.05）。④蛋白表达与其他临床病理特征无显著相关性。结论中国人sFRP1蛋白表达下降可能是肝癌发生发展中的重要因素之一,该蛋白的高表达可提示中国人肝癌的预后良好,同时,LOH是sFRP1基因表达沉默的机制之一,在sFRP1蛋白表达缺失中发挥了重要角色,因此该基因的遗传不稳定性可能是肝癌患者预后的一个指标。