抗肿瘤活性菌的培养优化及活性物质研究

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由于动植物资源的不合理开发和利用,带来了一系列环境问题,人们开始意识到微生物资源的重要性。在微生物资源的开发过程中,微生物药物,尤其是抗肿瘤微生物药物的开发,渐渐成为该领域的研究热点。本文选取了在前期研究中发现的两株抗肿瘤活性菌株,米曲霉Aspergillus oryzae YX-5和微小链霉菌Streptomyces parvulus HY026,对其发酵培养基进行优化,以优化后的培养基开展规模化发酵,提取出代谢产物,以抗肿瘤活性为指导,分离出其中的活性物质,对其进行结构鉴定。通过本文的研究可为环境微生物资源的开发提供一定的理论基础和潜在的应用价值。本文的主要研究结果如下:(1)以察氏培养基为基础培养基,以发酵后的菌体干重、粗提物质量和粗提物抗肿瘤活性为指标,通过单因素实验选出合适的碳源和氮源,再以选出的碳源、氮源以及K2HPO4、MgSO4·7H2O、KC1共5个因素进行正交实验,确定米曲霉A. oryzae YX-5的最适发酵培养基配方,最终确定的培养基配方为:葡萄糖45g/L,蛋白胨8g/L, K2HPO40.5g/L, MgSO4·7H2O0.2g/L, KC11g/L, FeSO40.01g/L。优化后菌体干重、代谢物的产量和抗肿瘤活性分别提高了41.88%、226.52%和19.31%。(2)以高氏一号培养基为基础培养基,通过单因素实验选出适合微小链霉菌S.parvulus HY026的碳源和氮源,最终确定的培养基配方为:可溶性淀粉20.0g/L,黄豆粉20.0g/L, K2HPO40.5g/L, MgSO4·7H2O0.5g/L, NaCl0.5g/L, FeSO4·7H2O0.01g/L。优化后菌体干重、代谢物的产量和抗肿瘤活性分别提高了299.22%,65.31%和27.58%。通过对两株菌发酵培养基的优化,明显提高了代谢物质产量和抗肿瘤活性,这对后期的规模化发酵中减小发酵规模和降低工作量十分有利。(3)米曲霉A. oryzae YX-5经规模化发酵60L后得到粗提物22.91g,以极性大小为依据,对粗提物进行两次减压硅胶柱层析,活性组分主要集中在30:1、20:1和15:1的二氯甲烷/甲醇相中,将这些活性组分混合,进行减压ODS柱层析,甲醇水梯度洗脱,分段收集,经抗肿瘤活性测试发现活性较高的组分为50%和60%甲醇洗脱的馏分,这两个组分的极性相近,因此将这两个组分混合,以分子量大小为依据,经葡萄糖凝胶柱层析,得到纯度较高的活性组分,经过核磁共振分析和质谱分析,确定其为羟基曲霉酸。(4)微小链霉菌S. parvulus HY026经规模化发酵80L后得到粗提物5.013g,以不同比例的二氯甲烷/甲醇溶液作为洗脱溶剂,经两次减压硅胶柱层析,得到两个纯度较高的活性组分,经HPLC检测发现两个组分中主要成分一致,对其进行核磁共振分析和质谱分析,确定其为放线菌素D。
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