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背景胰腺导管腺癌（pancreatic ductal carcinoma,PDAC）是一种预后极差的消化系统恶性肿瘤,易出现局部血管侵犯或远处转移,目前缺乏评估患者预后的有效血液标志物。循环肿瘤内皮细胞（circulatingtumor endothelial cells,CTECs）是指从受损的肿瘤血管脱落到循环血液中的成熟内皮细胞,作为评估预后、评价肿瘤血管形成能力及反映药物疗效的指标,已被应用于多种恶性肿瘤,但在胰腺癌中报道较少。此外,由于CTECs在外周血中总量少,难以有效捕获,对CTECs的下游分析存在较大困难。基于二代测序（next-generationsequencing,NGS）的单细胞全外显子组测序技术能够准确地完成全外显子组扩增,获得理想的测序深度,从单个细胞的水平分析肿瘤,在循环稀有细胞如循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells,CTCs）的研究中已有应用,而这一技术目前尚未应用于CTECs研究领域。从单个细胞层面探究CTECs的分子特征与关键突变具有重要意义。由于血管形成能力在恶性肿瘤的生长侵袭中起到重要作用,而CTECs是评估肿瘤血管形成的重要指标,探究胰腺癌中血管形成与预后的关系对肿瘤的治疗与评估意义重大。目的1.完成胰腺癌患者外周血中CTECs的检测,并探究其与预后的相关性。2.从单细胞角度探究胰腺癌CTECs的关键突变与分子特点。3.研究肿瘤干细胞特性及血管形成与预后的关系。方法1.使用差相富集-免疫荧光原位杂交技术（subtraction enrichment and immunostaining-fluorescence in situ hybridization,SE-iFISH）对胰腺癌患者外周血的CTECs进行检测,并利用Cox单因素及多因素回归分析、Kaplan-Meier生存分析、Spearman相关性分析等方法分析CTECs及其各亚型与患者临床资料间的关系。2.分离胰腺癌患者单个CTEC、白细胞样本,利用单细胞全外显子组测序（whole-exome sequencing,WES）的方法对CTEC单细胞样本、原位肿瘤组织石蜡标本与配对的白细胞与配对的进行测序分析,检测样本中的体细胞单核苷酸变异（singlenucleotide variant,SNV）、插入和删失（insertionanddeletion,InDel）、拷贝数变异（copynumber variation,CNV）、突变特征等信息,并利用生物信息学分析的方法寻找高频突变与驱动基因突变。3.对胰腺癌患者原位肿瘤中肿瘤干细胞标志物CD44进行免疫组化（immunohistochemistry,IHC）染色评分并利用 CD31 评估微血管密度（microvascular density,MVD）,利用Cox单因素及多因素回归分析、Kaplan-Meier生存分析、Spearman相关性分析等方法分析CD44及MVD与患者预后的关系。结果1.使用SE-iFISH法检测73例PDAC患者术前、术后7天（postoperative day 7,POD7）与术后1月（postoperative month 1,POM1）的外周血CTECs水平。中位随访时间为10.8个月,发现糖尿病病史（P=0.017）、阳性淋巴结数（P<0.017）、术前CD44+CTEC水平（P=0.004）、POM1 CA19-9（P<0.001）是胰腺癌术后DFS的独立预后因素;糖尿病病史（P=0.004）、POM1 CA19-9水平（P=0.026）是胰腺癌术后OS的独立预后因素。2.在4例胰腺癌原位肿瘤石蜡标本与13例CTEC样本中,共检测到131783个SNVs、24809个InDels。原发肿瘤间CNV模式较为一致,而CTECs的CNV模式与原发肿瘤不同,且CTECs间CNV模式异质性较大。全部样本中C>T/G>A突变增加,T>G/A>C突变减少,与COSMIC数据库中突变特征4、突变特征5显著相似。获得TTN、CMYA5、AHNAK 等 1505 个高频突变,PRRC2A、SRCAP、RNF213 等 770 个驱动基因。CD44+CTECs中存在UBR4、TTN、TEP1等特异性高频突变,及CUX1、MYH11、DCTN1等特异性驱动基因突变。3.对39例胰腺癌组织标本进行CD44的免疫组化染色分析,并分析相关临床因素与预后的关系,发现肿瘤直径（P=0.020）、肿瘤分化程度（P=0.010）、CD44染色指数（P<0.001）是胰腺癌DFS的独立预后因素,同时,CD44染色指数（P<0.001）是OS的独立预后因素。CD44表达与肿瘤低分化（Spearman相关系数0.339,P=0.035）、MVD（Spearman 相关系数 0.485,P=0.002）显著相关。结论术前CD44+CTECs是提示胰腺癌术后早期复发的独立预后因素。胰腺癌CTECs与原发肿瘤相比存在较大异质性;突变特征4、突变特征5,以及UBR4、TTN、TEP1等CD44+CTECs中特有的基因可能起重要作用。胰腺癌组织中CD44表达强度与微血管密度显著相关,并且是预后的独立因素。