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研究目的:通过混合游离脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)作用于大鼠肺微血管内皮细胞以建立大鼠脂肪栓塞综合征(Fat embolism syndrome,FES)的细胞模型,通过检测细胞模型中炎症因子的变化,检测内源性脂氧素A4(LXA4)及脂氧素A4受体(ALX)表达水平的变化,来探讨脂氧素A4及脂氧素A4受体在脂肪栓塞综合征发病过程中的细胞调控及其机制。研究方法:选取平均体重为80～120g的健康成年清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠进行手术,取材大鼠肺微血管内皮细胞,进行原代细胞培养并对其进行细胞形态学和FITC-BSI结合试验的鉴定[1]。通过棕榈酸、硬脂酸、油酸和花生四烯酸四种脂肪酸以1:1:1:1比例混合溶解于0.01mol/L的NaOH溶液中制作混合游离脂肪酸,作用于大鼠肺微血管内皮细胞,从而建立大鼠脂肪栓塞综合征细胞模型[2]。将混合游离脂肪酸制备成O.lmM,0.5mM和1mM三种不同的浓度,根据混合游离脂肪酸不同的浓度不同的作用时间来作用于大鼠肺微血管内皮细胞进行分组[2]。通过酶联免疫吸附法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)测定混合游离脂肪酸作用于大鼠肺微血管内皮细胞时炎症因子IL-6,IL-10,TNF-α的变化。通过免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)和免疫组化技术(Immunohistochemistry,IHC)来验证大鼠肺微血管内皮细胞上脂氧素A4受体的表达。通过蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot法来检测脂氧素A4受体的表达。通过Real-time PCR法检测脂氧素A4受体mRNA的表达。观察在运用脂氧素A4和脂氧素A4受体拮抗剂(Boc-2)后,混合游离脂肪酸作用后的大鼠肺微血管内皮细胞内炎症反应的变化。用Western Blot法检测混合游离脂肪酸处理后的大鼠肺微血管内皮细胞内p38 MAPK、JNK MAPK、ERK MAPK蛋白磷酸化水平的变化。使用主要通路的激动剂和拮抗剂,以确认激动或阻断通路是否会改变混合游离脂肪酸对大鼠肺微血管内皮细胞的影响从而探索脂氧素A4及其受体起作用的信号通路机制。研究结果:在经浓度为0.5mM混合游离脂肪酸作用12和24小时后的大鼠肺微血管内皮细胞内的炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α,较空白对照组明显升高(P<0.05)。免疫荧光技术和免疫组化技术证实了脂氧素A4受体在大鼠肺微血管内皮细胞的表达。脂氧素A4在混合游离脂肪酸处理过的大鼠肺微血管内皮细胞组较空白对照组明显升高(p<0.05)。Western blot检测显示脂氧素A4受体在混合游离脂肪酸浓度为0.5mM时较空白对照组明显升高(P<0.05),在作用时间为12小时时较空白对照组明显升高(P<0.05)。Real-time PCR检测显示脂氧素A4受体mRNA在混合游离脂肪酸浓度为0.5mM时较空白对照组明显升高(P<0.05),在作用时间为12小时时较空白对照组明显升高(P<0.05)。Western blot检测脂氧素A4受体蛋白结果与Real-time PCR检测脂氧素A4受体mRNA结果相一致。混合游离脂肪酸处理过的大鼠肺微血管内皮细胞内的炎症因子IL-6,IL-10,TNF-α在使用生物学效应比较稳定的外源性脂氧素A4[5(S),6(R)-Lipoxin A4]后较游离脂肪酸组明显降低(P<0.05)。而在使用脂氧素A4受体拮抗剂Boc-2后,炎症因子IL-6,IL-10,TNF-α较对照组升高,显示Boc-2拮抗了脂氧素A4的抗炎作用。Western blot检测结果显示磷酸化JNK,磷酸化ERK蛋白表达量在游离脂肪酸组与空白对照组比较无统计学差异(p>0.05),而磷酸化p38(p-p38)蛋白表达量在游离脂肪酸组与空白对照组比较有明显升高(P<0.05)。在使用生物学效应稳定的外源性脂氧素A4[5(S),6(R)-Lipoxin A4]后,磷酸化p38(0-p38)蛋白表达量较游离脂肪酸组明显降低(P<0.05)。在使用p38通路阻滞剂SB203580抑制p38通路后,与外源性脂氧素A4组比较,磷酸化p38(p-p38)蛋白表达量明显升高(p<0.05)。研究结论:1.在游离脂肪酸作用于大鼠肺微血管内皮细胞建立的大鼠脂肪栓塞综合征的细胞模型中,可观察到炎症反应的激活2.脂氧素A4受体在大鼠肺微血管内皮细胞上是明确表达的3.在游离脂肪酸作用于大鼠肺微血管内皮细胞建立的大鼠脂肪栓塞综合征的细胞模型中,LXA4的合成和ALX、ALX mRNA表达增加4.应用LXA4预处理,可降低炎症介质释放水平,抑制炎症反应;Boc-2可逆转以上改变5.在游离脂肪酸作用于大鼠肺微血管内皮细胞建立的大鼠脂肪栓塞综合征的细胞模型中,p38 MAPK信号通路被激活,抑制p38 MAPK通路可抵消LXA4的抗炎作用