降香黄檀与多裂黄檀木材DNA提取及其rDNA-ITS序列分析

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 9次 | 上传用户:aihuibulai
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木材是一种在人类生存和发展过程中不可或缺的可再生资源。在人们的生产、生活中,木材的保护和合理利用成为人们所关注的焦点。随着时代的发展和人们生活水平的不断提高,木制材料在生活中的应用越来越受到人们的青睐,特别是一些高档名贵木材制品也跻身于奢饰品行列,成为人们追求生活品质的象征。正是由于这些珍稀名贵木材与普通木材在价格上差距不断增大,导致一些不法分子利益熏心,将一些容易混淆和不易区分的树种以及木材制品当做名贵珍稀树种和木材制品进行销售,极大地扰乱了红木市场、仿古木市场、古典家具市场和名贵乐器市场的正常秩序,在经济上和精神上给消费者带来了巨大的损失和打击。因此,在木材加工、利用、使用和贸易活动中,对木材进行科学、快速、准确的识别和鉴定显得尤为重要和迫切。相比较传统的木材识别方法而言,DNA分析是一种有效地鉴别木材的方法。本论文以不同产地人工林中采取的降香黄檀(Dalbergia odorifera T. Chen)木材和多裂黄檀(Dalbergia rimosa Roxb)木材为研究对象,采用改良的CTAB法,PTB法(N-phenacylthiazolium bromide)和DNA抽提试剂盒(QIAGEN)三种方法分别对不同产地、不同部位、不同干燥处理方式的降香黄檀以及多裂黄檀木材的DNA进行提取、纯化、5.8S rDNA和ITS序列测序,分析不同部位和不同干燥方式对降香黄檀木材DNA提取及DNA序列扩增的影响,揭示不同产地降香黄檀DNA序列之间的差异以及降香黄檀和多裂黄檀DNA序列之间的差异,为利用rDNA-ITS序列鉴定降香黄檀木材及其常见混伪品提供理论依据。研究结果如下:1.三种方法(改良的CTAB法,PTB法和DNA抽提试剂盒)从边材和心材部位提取DNA浓度范围分别为:75.95-937.38ng/μL,4.46-806.56ng/μL,其中PTB法从边材和心材部位提取的DNA浓度都是最高的,采用试剂盒法提取得到的DNA浓度都是最低的。三种方法提取的边材部位DNA经纯化处理后能够满足PCR扩增目的片段的要求;只有PTB法提取的心材部位的DNA经纯化处理后能够满足PCR扩增目的片段的要求。三种方法都能够从边材组织中提取出DNA,PTB法更适合从心材组织中提取DNA。2.不同干燥温度处理对降香黄檀心、边材DNA及PCR扩增ITS序列影响。结果表明:经25℃和65℃温度处理后的心、边材基因组,凝胶电泳检测呈现不同程度的弥散分布,DNA降解片段范围分布15000bp以下,105℃干燥处理后的心、边材基因组均降解成250bp以下的小片段。心材部分经不同温度(25℃,65℃,105℃)干燥处理后,PCR扩增均是失败的,只有25℃处理后的边材ITS序列能够被扩增出来。根据本试验结果可推断,PCR扩增ITS序列失败,是由于随着干燥温度的升高导致木材基因组DNA降解程度加剧,且都呈现小片段化,无法满足PCR扩增模板的要求。干燥温度越高,对PCR扩增ITS序列影响越大。3.通过使用根据GenBank数据库中已登录的豆科黄檀属18S、26S基因保守序列设计的特异性引物(JT1-JT2),能够有效地避免内生菌的干扰,成功地扩增出ITS序列。通过对PCR反应体系的调整及优化,最终确定了扩增ITS序列最优的反应体系及参数,其中关键的参数和条件确定为:引物浓度为1.5μM,Mg2+浓度为2.0mM,退火温度为56.4℃。4.通过对不同产地的降香黄檀ITS序列和降香黄檀与多裂黄檀ITS序列比较,结果显示,不同产地的降香黄檀和多裂黄檀ITS(包括5.8S)序列的长度均为603bp,降香黄檀和多裂黄檀的5.8S长度均为164bp,且编码区5.8S相当保守并未发现变异位点,不同产地降香黄檀ITS序列差异很小。降香黄檀和多裂黄檀ITS2区变异分布明显大于ITS1区,二者的ITS区域共有6个变异位点,这6个位点可以作为鉴别降香黄檀和其近缘种的ITS特异性位点。系统发育树研究表明,降香黄檀与多裂黄檀有着稳定的遗传差异性,这种差异性主要体现在二者ITS碱基序列的变异性上,同时也说明降香黄檀与多裂黄檀在黄檀属中有着较近的亲缘关系,但是二者又不属于同一植物类群。
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