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硝基酚是一种重要的环境污染物，包括三种同分异构体，2-硝基酚(ortho-nitrophenol)、3-硝基酚（meta-nitrophenol）、4-硝基酚（para-nitrophenol）。它们都是重要的化工原料，常作为医药、染料、农药等精细化工的中间体的生产。由于硝基酚拥有稳定的苯环结构和硝基基团，在环境中能长期存在;能抑制许多生物学机能，对人类健康和生态环境具有很强的危害，被美国环保局列入优先污染物名单(Priority Pollutant List)。 在自然选择压力下，许多微生物进化出了相应的代谢途径分解这些化合物，多株可以完全降解单硝基酚的细菌报道，但目前尚无能同时降解三种单硝基酚同分异构体的报道;已有的关于硝基酚代谢途径的研究基础和合成生物学的发展为利用代谢工程的手段构建能够降解三种硝基酚的工程菌成为可能。 本研究分为两个部分; 第一部分是以4-硝基酚降解菌Pseudomonas sp.WBC-3为底盘生物构建能降解三种硝基酚的工程菌。 Pseudomonas sp.WBC-3是一株能够利用甲基对硫磷(Methylparathion，MP)和4-硝基酚(4-Nitrophenol，4-NP or PNP)作为底物生长的革兰氏阴性菌，并且能够利用2-硝基酚的代谢中间产物邻苯二酚(catechol，CA)作为唯一碳源和能源生长;此外，3-硝基酚的中间代谢产物β-酮己二酸也是4-硝基酚的中间代谢产物。基于此，克隆2-硝基酚降解菌Alcaligenes sp.strain NyZ215中将2-硝基酚代谢为邻苯二酚的onpAB基因和3-硝基酚降解菌Cupriavidus necatorJMP134中将3-硝基酚代谢为β-酮己二酸的mnpDERAC基因，然后利用同源重组的方法转入4-硝基酚降解菌Pseudomonas sp.WBC-3，有望构建能够同时降解三种硝基酚的工程菌。在工程菌的构建过程中，由于Pseudomonas sp.WBC-3遗传背景的复杂性，在没有选择压力的情况下，单交换菌株不稳定极易回复突变为野生型菌株，用常规的筛选方法无法筛选到无抗性标记的目标双交换菌株。针对实验中遇到的问题，我们提出了一种gfp-based的高通量筛选方法-荧光标记法来对目标双交换菌株进行筛选，在筛选106～107个菌落之后，还是没能筛选到我们所需要的突变株。 第二部分是以3-硝基酚降解菌Cupriavidus necator JMP134为底盘生物构建能降解三种硝基酚的工程菌。 3-硝基酚降解菌Cupriavidus necator JMP134能够降解60多种芳香族污染物;含有多条代谢途径，其中包括邻苯二酚代谢途径和对苯二酚代谢途径，而2-硝基酚和4-硝基酚也可以分别通过邻苯二酚代谢途径和对苯二酚代谢途径代谢。在2-硝基酚降解菌Alcaligenes sp.strain NyZ215中，onpABC基因簇的编码产物能够将2-硝基酚顺序催化为邻苯二酚代谢途径的中间产物顺式-粘康酸;在4-硝基酚降解菌Pseudomonas sp.WBC-3中，pnpABCD基因的编码产物够将4-硝基酚顺序催化为对苯二酚的中间代谢产物γ-羟基粘康酸半醛;基于以上的背景，我们将onpABC基因簇通过同源重组的方法整合到C.necator JMP134染色体上，借助gfp-based荧光标记的方法成功筛选到含有onpABC基因簇、不含抗性标记、能同时降解2-硝基酚和3-硝基酚的基因工程菌JMP134-ONP，验证了荧光标记法的可行性。此外，我们将来自4-硝基酚降解菌Pseudomonas sp.WBC-3，处于三个操纵子上与PNP代谢相关的基因pnpABCD，体外重排后转入C.necatorJMP134，构建了能够利用4-硝基酚作为底物生长，且能同时利用3-硝基酚，同时4-硝基酚生长的工程菌JMP134-PNP;在体外验证了Pseudomonas sp.WBC-3中降解4-硝基酚的基因簇;最后基于上述的研究结果，我们将pnpABCD基因转入2-硝基酚和3-硝基酚降解菌JMP134-ONP，构建了工程菌JMP134-OMP并对其降解三种硝基酚的能力进行了初步的研究。