背景：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是世界范围内导致病毒相关性慢性肝脏疾病最常见的原因之一。据估计全世界约有3亿慢性HBV携带者,我国的HBV感染者约为1.2亿。慢性HBV感染可引起包括无症状携带、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)、肝硬化和肝癌,或进展为肝衰竭(liver failure, LF)的一系列肝脏疾病谱。慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)是在慢性乙肝病毒感染基础上,由于病毒复制、感染、内毒素血症及劳累饮酒等诱因,引起的肝脏急性炎症加重,肝脏发生大块或亚大块坏死,导致病情急剧加重,引起肝衰竭。中国80%的ACLF患者与HBV感染相关。ACLF的死亡率很高,在未进行肝移植的患者中高达(60-80)%。在CHB基础上进展为肝衰竭的机制复杂,HBV病毒和机体免疫的因素都起着重要的作用。既往文献报道HBV病毒变异,特别是前C区终止密码子(G1896A,PC)和基本核心启动子(basie core promoter, A1762T/G1764A, BCP)的变异率在急性肝衰竭的患者中明显升高；PC和BCP变异下调了作为免疫耐受原的HBeAg,血清中HBeAg下降或缺如,导致HBcAg表达增加,使Th1辅助细胞发动细胞毒性T细胞(cytoxic T lymphocyte, CTL)攻击感染的肝细胞,从而导致肝细胞坏死。HBcAg作为CTL靶抗原,包含有多个能被CTL识别的表位(epitope)。表位是特异性细胞免疫应答得以激发的主要原动力,处于免疫识别和免疫激活的核心位置。核苷酸的转换、插入和缺失可导致氨基酸的有义突变,当这种突变影响到病毒的特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞表位的序列和序列构象时,进一步会影响与HLA分子的结合力或与B、T淋巴细胞受体的结合力,从而影响宿主针对病毒的免疫应答能力。在一些肿瘤和其他病毒细胞免疫应答方面,研究已证实基因变异会导致T细胞表位漂移(epitope drift),从而改变了表位的免疫原性,进而影响疾病的发展与预后。目的：以中国广东地区ACLF患者为主要对象,从HBV变异影响基因转录调控和影响宿主免疫应答两个方面,探讨病毒变异与ACLF患者发病的关系。方法：39例ACLF患者和38例严重肝炎活动患者(severe hepatitis B, SHB)作为主要研究对象。其中ACLF诊断标准：在慢性肝病的基础上急性起病,15天至26周出现以下临床表现者：①极度乏力,有明显的消化道症状；②黄疸迅速加深,血清总胆红素(TB)≥正常值上限10倍,或每日上升≥17.1μmol／1；③凝血酶原时间明显延长,凝血酶原活动度(PTA)≤40%。SHB定义参照文献的报道：丙氨酸转氨酶(ALT)≥600U／l、TB≥51.3μmol／l和PTA≤50%。作为对照组的44例CHB患者定义为：HBV表面抗原(HBsAg)阳性半年以上,出现的轻度或中度肝炎活动,即ALT波动于(80-400)U／l和TB≤17.1μmol／l。以上患者临床和实验室检查均无明显肝硬化征象。ACLF和SHB的患者平均随访10.6月(最长17个月,最短3个月)。采集患者的临床资料和血清标本。抽提DNA,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增和测序HBV前C／C区,通过克隆测序的方法对HBV混合株感染加以验证。通过生物预测网站SYFPEITHI和BIMAS分析线性Th细胞表位和CTL表位发生变异后与HLA分子的结合能力,用HBcAg X线衍射3D结构分析B细胞表位变异后构型的改变。用五聚体染色(pentamer staining)技术探讨表位免疫原性的改变。结果：1)临床资料的比较：ACLF组与SHB组比较TB的水平明显升高,而ALB及PTA均降低；差异均有统计学意义；反映肾功能的指标血肌酐(Cr)(99.4±94.7vs.75.0±14.1；P<0.001)和判断是否合并感染的指标白细胞总数(WBC)[8.0±3.2(×109／l)vs.6.2±2.1(×109／l)；P=0.005]在ACLF组也升高。两组之间HBV基因型分布和BCP、PC变异发生率均无明显差异。ACLF中死亡组与存活组相比：PTA明显降低,WBC明显升高,差异均有统计学意义；Cr也较存活组高,但无显著性差异(P=0.072)。2)HBV基因型：ACLF和SHB两组均以基因B型和C型为主,有1例患者为基因D型；5例患者由于HBV DNA定量低,PCR扩增失败未鉴定基因型,未纳入统计。其中基因B型比率分别高达(26／35,72.2%)和(24／36,68.6%),均高于CHB组(22／44,50%)。SHB组与CHB比较有统计学差异(P=0.044)；ACLF组也较CHB组升高,但无统计学意义(P=0.069)。3)C基因调控区变异(1) BCP(A1762T/G1764A)的变异率在ACLF中明显高于CHB组(56.7% vs.32.4%,P=0.046),PC(G1896A)变异率也显著高于CHB组(50% vs.15.9%,P=0.003)。用“-”表示未变异,用“+”代表变异来进行简化；ACLF组HBV发生BCP-/PC+和BCP+/PC+的比例明显高于CHB组,而BCP-／PC-的比例明显低于CHB组。(2)在BCP+/PC-、BCP-/PC-、BCP-/PC+和BCP+／PC+模式中HBeAg的阴性率逐步升高,分别为在40%、53%、76.5%和83.3%；而且BCP-／PC+和BCP+/PC+模式下调HBeAg的作用比其他两种模式明显增强；在单变异模式中PC变异下调HBeAg的作用较BCP变异明显(P=0.001)。(3)nt1846 A-T变异的发生率在ACLF组明显高于SHB组[80.6%(25／31)vs.16.7%(5／30),P<0.001]及CHB组[80.6%(25／31)vs.11.1%(4／36),P<0.001]。而该变异位点与本研究中患者的基因型分布无相关性。(4) BCP-/PC-模式中HBeAg阴性率在四种模式中并非最低；进一步分析在这种模式中ACLF的患者均为HBeAg阴性。而这部分ACLF的患者HBV DNA定量与该模式中SHB的患者无差异。4) C基因编码区变异(1)C基因编码区氨基酸发生变异的频率在ACLF组明显高于CHB组。在ACLF中氨基酸变异率超过10%,且与CHB组比较有统计学差异的共有7个位点。这些高频率的变异位点绝大部分位于表位区域：aa5、aa35和aa60分别位于的Thl-20、Th35-45和Th49-69辅助细胞表位区,aa27位于CTL18-27细胞毒性T细胞表位区,aa83和aa135分别位于B76-87和B130-135表位区。进一步统计以上表位区变异的频率显示：ACLF在各个表位区变异频率均高于CHB组。(2)aa5和aa60变异存在明显的相关性,Pearson相关系数为0.632(P<0.001)。并且这两点在随访中表现为协同共变异：即aa5位氨基酸发生P-T的变异,同时观察到aa60发生L-V的变异；或aa5 T-P协同aa60 V-L。HBcAg晶体3D结构显示,aa5和aa60在空间构型上位置相邻,分享同一个四螺旋束(four-helix bundle)。网站预测aa5和aa60所在的肽段作为潜在的CTL表位与HLA分子的结合力,显示aa5发生P-T的变异后引起所在的肽段与HLA-A*0201分子的结合分数升高了3分(13 vs.16)；而aa60 L-V的变异后所在肽段与HLA-A*0201分子的结合分数降低。(3)对于高变异位点所位于的已知线性Th细胞表位和CTL表位通过生物学网站预测其免疫原性的改变；对于空间构象型B细胞表位用HBcAg X衍射3D结构分析其构型的改变。通过HBcAg晶体结构分析构象性B细胞表位显示,高变异位点所在的B细胞表位均位于HBcAg结构中向外侧突出的位置；而在B细胞表位HBcAg130-135中,aa135处于最向外突出的点。CTL表位HBcAg18-27发生27位I-V的变异后,SYFPEITHI评分显示与HLA-A*0201分子的结合分数升高了2分(24 vs.22)；BIMAS评分显示HBcAg18-27(V27)与HLA-A*0201结合的分数为2309.961,而I27为346.494。5)表位HBcAg18-27(1)HLA-A*0201限制性特异性CTL表位HBcAg18-27,在中国I27的背景下,ACLF组V27变异率高。在ACLF组V27的发生率明显高于CHB组,差异有统计学意义[10／39(25.6%)vs.3／44(6.8%)；P=0.019]；同样,SHB组V27的比率也高于CHB组[8／38(21.1%)vs.3／44(6.8%)；P=0.059]。(2)为了探讨表位HBcAg18-27的动态变化,随访了SHB和ACLF组中10例发病时V27单一病毒株感染或V27和I27混合株感染的患者,及19例发病时I27单一病毒株感染的患者。在4例HLA-A2阳性的患者中无论发病时是V27单一病毒株感染或是V27和I27混合株感染,随访后均变异成I27单一病毒株感染；而在5例HLA-A2阴性患者中,随访后包含V27的病毒仍能检测出。进一步的克隆测序,验证了V27向I27转换的变异模式。而18例发病时感染I27单一病毒株的患者随访后仍然为单一I27病毒株感染。(3)用五聚体技术,分析HBcAg18-27表位变异后免疫原性的差异。分离HLA-A2阳性ACLF和SHB患者的PBMC,用HBcAg18-27两种形式(I27和V27)的特异性五聚体直接检测分析特异性CD8细胞的频数；直接检测的结果显示特异性CD8细胞的频数较低,两组之间无统计学差异。对于直接检测后仍有余留PBMC的患者,将其PBMC增殖培养13天后再进行五聚体染色：在案例报道中显示HBcAg18-27(V27)特异性CD8细胞的频数高于HBcAg18-27(127)特异性CD8细胞的频数。(4)在ACLF和SHB的患者中,aa27V患者HBV DNA定量低于aa27I的患者,尽管差异无统计学意义(P=0.093)。而ACLF组HBV DNA定量明显低于CHB组[(5.75±1.73 vs.9.16±1.72)log10 copies/ml；P<0.001],SHB组也低于CHB组[(5.55±1.61 vs.9.16±1.72)1og10copies/ml；P<0.001].结论：1)与从SHB进展为ACLF相关的因素包括：TB、Cr和WBC的升高,ALB和PTA的降低。在ACLF中,PTA下降及WBC升高与不良结局相关。2)基因B型在ACLF和SHB两组比率均高于CHB组,且SHB组与CHB组比较有统计学意义。这表明在中国南方地区基因B型与严重的肝脏炎症活动发病相关。3) BCP(A1762T/G1764A)和PC(G1896A)变异率在ACLF组明显高于CHB组。ACLF组HBV发生BCP-／PC+和BCP+／PC+的比例明显高于CHB组,而BCP-／PC-比例明显低于CHB组。这个结果证实了A1762T／G1764A和G1896A高变异与ACLF发病的相关性。4)在BCP+/PC-、BCP-/PC-、BCP-/PC+和BCP+/PC+模式中HBeAg的阴性率逐步升高；而且BCP-／PC+和BCP+／PC+模式下调HBeAg的作用与其他两种模式相比明显增强；在单变异模式中PC变异下调HBeAg作用强于BCP变异；且在ACLF组BCP+／PC+和PC单变异的比例明显高于CHB组。这表明PC+和BCP+／PC+模式导致的HBeAg与ACLF发病相关。5)C基因编码区发生变异的频率在ACLF组明显高于CHB组。ACLF中氨基酸变异率明显升高的位点绝大部分位于表位区域。统计各个表位区变异的频率,在ACLF组均高于CHB组。这说明表位变异可能在ACLF发病中起着重要的作用。6)aa5和aa60变异存在明显的协同关系。两位点尽管在线性位置相隔远,但在HBcAg空间构型上位置相邻,分享HBcAg四聚体中同一个螺旋束。通过预测分析肽段发生aa5 P-T的变异后与HLA-A*0201结合力增强；提示aa5变异后可能提高表位的免疫原性、诱导更强的免疫反应；而aa5 P-T的变异在ACLF中明显升高(52.63%)；表明aa5T与ACLF的发病相关。aa60由于与aa5空间位置相邻,可能在极性、PH值、亲水性等多个因素的影响下,出现协同变异。7)HLA-A2限制性CTL表位HBcAg18-27(V27)在ACLF组的比率明显升高,且随访后ACLF患者中,HLA-A2阳性的患者均变异I27；且HBcAg18-27(V27)特异性CD8细胞的频数高于HBcAg18-27(127)特异性CD8细胞的频数。这表明HBcAg18-27(27V)在HLA-A2阳性患者中引起较强的免疫应答,在清除了aa27V病毒的同时,导致了肝脏炎症的发生,与ACLF的发病相关。