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沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌是常见的8种食源性致病菌。本文以上述8种致病菌为研究对象,设计了6对引物,并结合文献报道的2对引物,分别建立了检测食品中大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌的含扩增内标PCR检测方法,以及一种同时检测食品中上述8种致病菌的添加扩增内标的两管同步多重PCR检测方法。首先,对6种添加扩增内标的单种细菌PCR检测方法进行了评价,测定了其特异性、灵敏度和人工污染样品检出限。特异性试验结果显示,6种PCR检测方法均具有良好的特异性。灵敏度试验及人工污染试验结果显示,添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法对沙门氏菌纯DNA模板和纯培养物的检测灵敏度分别为61.11 fg/μL和2 ×102 CFU/mL,对人工污染鸡蛋中沙门氏菌的检出限为2 CFU/25 mL;添加扩增内标的大肠杆菌0157:H7 PCR检测方法对大肠杆菌O157:H7基因组DNA和纯培养物检测灵敏度为3.18×102 fg/μL和2.2×102CFU/mL,对人工污染牛乳中大肠杆菌0157:H7的检出限为2.2 CFU/mL;添加扩增内标的志贺氏菌PCR检测方法对志贺氏菌纯基因组DNA和纯培养物检测灵敏度分别为7.55× 102 fg/μL和31 CFU/mL,对人工污染猪肉中志贺氏菌的检出限为0.31 CFU/g;添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法对单增李斯特菌纯DNA模板和纯培养物的检测灵敏度分别为1.80×102 fg/μL和1.21×102 CFU/mL,对人工污染牛乳中单增李斯特菌的检出限为0.48 CFU/mL;添加扩增内标的蜡样芽孢杆菌PCR检测方法对蜡样芽孢杆菌基因组DNA和纯培养物检测灵敏度分别为2.68×102 fg/μL和7.97×103CFU/mL,对人工污染牛乳中蜡样芽孢杆菌的检出限为8 CFU/mL;添加扩增内标的阪崎克罗诺杆菌PCR检测方法对阪崎克罗诺杆菌基因组DNA模板和纯培养物的检测灵敏度分别为2.15×102 fg/μL和9.4×103 CFU/mL,对人工污染奶粉中阪崎克罗诺杆菌的检出限为0.94CFU/g。多重PCR反应分两管进行,其中反应管1检测副溶血性弧菌、大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌、志贺氏菌;反应管2检测单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌。试验过程对多重PCR反应体系中的引物、聚合酶、镁离子和dNTPs的添加量以及多重PCR反应条件中的退火温度、延伸时间和循环次数进行了优化,确定了最佳的多重PCR反应体系和反应条件。对多重PCR产物进行DNA测序,测序结果显示多重PCR扩增产物确实为目标产物。对24株细菌进行检测,试验结果表明该多重PCR检测方法特异性良好。灵敏度试验表明,该检测方法对副溶血性弧菌、大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA的检测灵敏度依次分别为104、104、103、102、103、103、102、102 fg/μL,对纯培养物的检测灵敏度分别为103、103、104、103、104、104、10、10 CFU/mL。人工污染八种致病菌的猪肉,经过12 h增菌富集培养后,进行多重PCR检测,副溶血性弧菌的检出限为102 CFU/g,大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌检出限为10CFU/g,志贺氏菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎克罗诺杆菌和金黄色葡萄菌检出限为1 CFU/g。