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现已研究表明,基因组序列上的变异,即基因多态性(gene polymorphism)是决定人体对疾病易感性与抵抗性、疾病临床表型多样性以及人体对药物治疗反应差异性的重要因素。我们既往研究表明,效应细胞表面模式识别受体(CD14、Toll-like receptor 4、MD2)、细胞内信号转导途径中的蛋白激酶、以及由炎症细胞产生的促炎介质如TNF(、IL-1(、IL-6、IL-8,抗炎症介质如IL-4、IL-10、IL-1Ra在决定脓毒症发生发展和转归中发挥重要作用。因此,其基因表达上的差异,很可能是部分患者易发生脓毒症或/和预后较差的重要因素。为此,基于目前研究进展,本课题重点开展了三方面的系统研究:(1)选择18个与炎症反应最为密切的候选基因,通过大规模直接测序的方法对这些基因所有重要功能区域内的基因多态性进行了较全面分析;(2)分析了TLR4基因5’区-1892G→A和-1837A→G碱基变异在重庆人群中的发生频率及其SNP基因型和单倍型的分布特点;(3)利用生物信息学和基因克隆技术,探讨了TLR4基因5’区调控区以及-1892A和-1837G碱基变异的功能意义。旨在为揭示脓毒症发病易感性的分子基础提供实验依据。主要结果和结论如下:1. 分别从效应细胞受体、细胞内信号转导途径、促炎细胞因子和抗炎因子四个方面,选择了18个与炎症反应最为密切的候选基因,对基因5’区、5’非翻译区(5’UTR)、编码区、与外显子相邻的内含子区、3’UTR(3’UTR)和3’区进行了大规模直接测序分析,通过对我国10个民族(蒙古族、藏族、维吾尔族、傣族、布朗族、苗族、壮族、彝族、朝鲜族和汉族)人群中基因多态性的分析,初步建立了我国人群与炎症反应相关基因的SNP数据库。 2. 以重庆人群为观察对象,进一步系统分析了TLR4基因5’区-1892G→A、-1837A→G在中国人群中的发生频率及其SNP基因型和单倍型的分布特点。研究发现,-1892和-1837两位点不仅具有较高的碱基变异发生率,两位点的杂合度高,而且具有高度的连锁不平衡,两个位点同时发生碱基变异的发生率高达39.7%,G/A-A/G两点杂合子基因型最常见。 本课题受国家重点基础研究发展规划项目(编号G1999054203)资助<WP=9>3. 利用生物信息学以及基因克隆技术,探讨了TLR4基因5’区远端调控区的生物学意义。发现-1837 位点所在区域为多个转录激活因子如C/EBP,Oct-1和Oct-6的结合片段,-1892附近虽无转录激活因子识别片段,其G→A的变异可使-1892位点所在片段成为AP-1的识别序列。提示-1892和-1837两位点虽不在启动子区,但可能对靶基因表达具有一定的远端调控作用。基因克隆和转染结果显示,虽在-2413～-683片段内存在一个具有增强启动子活性的结构域,但该结构域可能位于-1336～-683之间,提示-1892和-1837 两位点所在片段(-2413～-1337)可能是通过其它调控机制影响靶基因的表达。