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猪繁殖障碍病在国内外都有严重发生,已成为大中型猪场最重要的疫病之一,并且呈全球性分布。我国当前以猪圆环病毒2型感染、猪细小病毒病、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟造成的猪繁殖障碍最为普遍和严重,特别是这几种病原常混合感染,可以引起70%以上的初产母猪发生流产、产死胎、弱仔,给养猪业造成巨大的经济损失。
本研究针对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)5种病原,建立复合PCR检测技术,并用该法对山东省胶东地区的猪场进行检测,从而了解该地区猪繁殖障碍病的发病情况,为猪场制定合理的免疫程序提供参考。
根据Genbank上PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV的已知序列,分别设计并合成了5对特异性扩增引物,建立PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV单项PCR检测方法,分别扩增出预期的466 bp、759 bp、349 bp、202 bp和707bp片段。对单项PCR反应条件(引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、退火温度和PCR反应程序)进行优化,筛选出最佳反应条件。
在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PCV2-PPV-PRV-PRRSV-CSFV复合PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了测定。结果表明:只有特异性引物与其特异性模板能扩增出预期大小的条带,与其它模扳没有任何扩增产物,表明该法特异性好;最低能检测到184pg/L的PCV2、248pg/L的PPV、5.3ng/L的PRV、25.6ng/L的PRRSV、15.28ng/L的CSFV的核酸模板,表明该法具有较高的敏感性;重复检测3次,其结果均一致,表明重复性好。
采用建立的PCV2-PPV-PRV-PRRSV-CSFV复合PCR检测方法,对山东省胶东地区送检的32份临床疑似病料进行了PCR检测,结果表明:32份样品中,PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV感染的阳性率分别为25.00%、0%、34.38%、71.88%和3.13%;共检出25份阳性病料,阳性率为78.13%,其中PRV-PRRSV双重感染的比例为31.25%,PCV2-PRV-PRRSV三种病原体混合感染的比例为25.00%。用单项PCR检测作对照,结果两者符合率为100%,表明该复合PCR检测方法具有较高的敏感性,可以进行临床猪圆环病毒2型感染、猪细小病毒病、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟的病原学快速诊断。