引言胰腺癌是一种具有高侵袭性的消化系统恶性肿瘤,起病隐匿,病程短,进展快,死亡率高。早期症状不典型,手术切除是目前唯一相对有效的治疗手段,而多数患者确诊时已为肿瘤晚期,失去了最佳治疗时机。神经浸润(perineural invasion,PNI)作为胰腺癌的一种特殊转移方式,在胰腺癌中发生率可达80%～100%,并与胰腺癌患者不良预后和低存活率相关,其涉及多种信号分子和不同的信号通路,但是具体机制尚不清楚。研究表明,自噬在肿瘤的发生中发挥着重要作用,与胰腺癌的发生、发展、分化及预后均有密切联系。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1A/1B-lightchain3,LC3)形成并且插入吞噬泡膜是自噬的关键步骤并参与了自噬体的形成,是哺乳动物细胞中常见的自噬小体标记蛋白之一,而且与胰腺癌患者不良预后直接相关。研究显示,LC3在胰腺癌患者转移的淋巴结及浸润的神经纤维中高表达,细胞自噬对胰腺癌的PNI及远处转移可能具有促进作用。只有那些能在神经组织中保持生存活性的胰腺癌细胞才能最终发展成为临床可见的胰腺癌PNI,而这种保持癌细胞生存活性的机制之一可能就是细胞自噬。目前尚无研究明确胰腺癌细胞自噬相关蛋白LC3与PNI之间是否存在关联。本研究首先收集临床病历资料,通过免疫组化和生存分析阐明胰腺癌细胞自噬蛋白LC3与PNI之间,以及它们与临床病理特征及生存预后的关系;然后基于LC3为指引,进行胰腺癌基因表达谱分析,寻找参与胰腺癌自噬的差异基因,通过构建蛋白质互作网络再对差异基因进行功能聚类,以聚类模块为单位研究模块间的相互作用,找到模块间相互作用的关键蛋白质(或基因),从分子水平探究LC3与PNI之间的关联。为阐明胰腺癌病理生理机制提供理论基础,也为胰腺癌的早期诊断及寻找治疗靶点提供分子机制研究基础。第一部分自噬相关蛋白LC3与胰腺癌PNI、临床病理特征以及预后关系的研究目的研究胰腺癌患者细胞自噬相关蛋白LC3与PNI、临床病例特征及预后的关系。方法回顾性收集2011.01-2016.08郑州大学第一附属医院手术切除并经病理结果证实为胰腺导管腺癌的患者109例,免疫组化法检测癌组织中PNI标记物泛素羧基末端水解酶(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase,UCH)及细胞自噬相关蛋白LC3的表达。分析LC3与PNI的相关性以及它们与临床病理特征的关系,并对随访资料完整的患者进行生存分析。结果109例胰腺癌组织中PNI阳性率68.8%(75/109),细胞自噬高表达率61.5%(67/109);PNI与患者淋巴结转移、胰腺炎以及CA199水平相关(P<0.05);LC3与患者淋巴结转移有关(P<0.05);LC3表达水平与PNI呈正相关(P<0.05,相关系数r=0.227)。Logistic多因素回归分析显示LC3、淋巴结转移、胰腺炎以及CA199水平为PNI的影响因素,而PNI是影响LC3表达的独立因素。总生存率的单因素分析发现LC3表达水平、PNI、CA199水平均与胰腺癌预后有关(P<0.05)。COX回归多因素生存分析发现:PNI、LC3表达水平是胰腺癌不良预后的独立危险因素(P<0.05)。小结胰腺癌患者PNI阳性率与细胞自噬相关蛋白LC3的高表达呈显著正相关,PNI、LC3水平是判断胰腺癌预后不良的独立危险因素。第二部分基于LC3为指引进行的胰腺癌自噬基因表达谱分析研究目的:从生物信息学角度探讨胰腺癌自噬相关蛋白LC3与PNI之间的关系。方法:从基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)收集两套胰腺癌/正常组织基因表达谱数据集(GSE16515和GSE15471),使用Robust Multi-array Average(RMA)算法由Affymetrix表达谱原始数据计算探针基因表达量,R语言的Annotate包结合芯片注释文档将探针集标记上对应的基因。将基因表达数据与临床特征数据(癌症样本与正常样本)关联,利用基因芯片显著性分析(SAM,Significance Analysis ofMicroarrays)算法筛选胰腺癌相关的差异表达基因((|log2(fold change)|>1;FDR(False Discovery Rate,错误发现率)<0.01);使用GO分析和KEGG Pathway对差异基因进行功能富集分析。从String数据库下载人类的蛋白质互作网络数据,筛选只包含差异表达基因的蛋白质互作数据,然后将差异表达基因的互作数据导入Cytoscape中,用ClusterOne插件进行模块挖掘,在分析结果中选择P值小于0.05的模块作为显著结果对差异基因进行注释。根据得到的功能模块信息和获得的可靠的蛋白质互作网络数据,分析模块间互作关系,寻找功能模块间的pivot节点。结果:由上述两套胰腺组织全基因表达谱数据集出发,分析与表型关联度较高的基因,分别获得了 6098和12928个差异表达基因,对两个差异基因集提取交集后获得4870个核心的差异表达基因。对差异基因进行GO分析,在分子功能、生物学过程和细胞组分三个方面,一共获得14个显著富集功能条目与自噬密切关联:肌动蛋白结合、蛋白酶结合、体外凋亡信号通路的负调控、无配体的体外凋亡信号通路、外源性凋亡信号通路、体外凋亡信号通路的负调控蛋白泛素化、蛋白质泛素化的负调控、蛋白质泛素化的调节、对金属离子的反应、蛋白水解的正性调控、蛋白酶-配体复合体、离子通道复合体、蛋白酶体复合物、蛋白酶体调节颗粒。这些功能条目一共富集了 986个差异表达基因,剔除Gene功能注释数据库明确界定的人类癌细胞自噬相关基因后,得到347个差异表达基因。另外,差异基因在KEGG上显著性分析显示:通路hsa04144与内噬作用相关,通路hsa04020与钙信号通路相关,都与自噬有一定的关系。基于蛋白质互作网络数据库String,构建包含2256个差异表达基因以及12632个互作对的蛋白质互作网络,通过模块挖掘,共筛选到65个聚类模块,其中模块32中包含LC3基因,使用网络图工具分析LC3基因及与其直接互作的互作基因,发现该基因与多个和自噬相关的基因之间有互作关系,并能形成功能模块,并在三个自噬相关基因ATG5、ATG7、ATG4A之间,起到了连接这些基因的作用;基于与自噬相关的模块和pivot发现,泛素C(ubiquitin C,UBC)在功能模块中作为pivot节点,连接多个与癌症和自噬相关的模块。KEGG分析发现了一个显著性非常高(p.adjust = 1.06E-07)的新通路 hsa04216(Ferroptosis),与铁死亡相关;另外GO分析也发现了一些新功能注释,GO:0016236参与了自噬过程;GO:0030666与内吞囊泡膜有关。小结:富集到了347个与人类癌细胞自噬过程尚未明确关联的基因,发现了若干与自噬相关的通路,为今后的研究工作提供了新的研究基础;通过基于自噬和LC3的Crosstalk分析找到了pivot基因泛素C,联系泛素羧基末端水解酶在PNI发生发展过程中的关键作用,我们推测LC3极有可能通过泛素C调控泛素-蛋白酶体系统进而影响胰腺癌的PNI。结论临床研究发现胰腺癌患者LC3高表达与PNI阳性率呈显著正相关,PNI的发生、LC3高表达是胰腺癌预后不良的独立危险因素。利用基因表达谱分析技术发现了 347个与人类癌细胞自噬过程尚未明确关联的基因,并富集出参与自噬的关键通路;提示LC3可能是通过泛素C影响胰腺癌PNI及预后。